临床检验仪器----临床分子生物仪器

        基因是决定遗传性状基本的功能单位，生物体完整结构（细胞器、膜结构等）的保证及各种功能的发挥有赖于多种基因的正常表达及相互调节，这些基因构成了一个生物体完整的基因组。 基因诊断(gene diagnosis)又称DNA(脱氧核糖核酸)诊断，是利用DNA重组技术，直 接从DNA水平来检测人类疾病的诊断手段。通过分析基因的类型和缺陷及其表达功能是 否正常来诊断疾病，它是继形态学、生物化学和免疫诊断之后的第凹代诊断技术。基因是遗 传的物质基础，它决定了病原体的生物学特性。除个别病毒外，现知的所有微生物均是以核酸为遗传物质的。病原体的基因既可以是DNA，也可以是RNA（核糖核酸）。基因诊断的目的就是要通过各种手段，如杂交、扩增等，去寻找和发现这些独特基因组、基因或基因片段的存在，从而证实某种病原体的存在。

        一．核酸合成仪器 早的核酸合成是手工完成的，以后逐步向半自动和自动化方向发展，并研制出多种型号的合成仪。核酸合成仪是体外合成寡核苷酸片段与探针的专用仪器。ABI3948型核酸合成与纯化系统是将核酸化学合成装置与核酸的过柱纯化结合起来的新一代核酸合成仪，将核酸化学合成装置与寡核苷酸纯化柱一体化设计，从合成仪上取得的核酸产品就是可直接使用的核酸纯品，这样既简化了操作步骤，提高了合成效率，同时又使合成过程的标准化程度得到加强，避免人为与环境造成的品质差异。

        （一）基本结构 一般合成仪主要由计算机系统、试剂输送系统组成，AB13948型合成仪增加了核酸合成与纯化系统。三个系统以试剂输送系统为关键，因为试剂输送的有效眭与精确性直接关系到核酸的合成是否成功。试剂输送系统主要由压力系统、试剂和溶液储液瓶、压力管路及输送管路、输送阀块、柱子、流路节流阀、废液和排气、电导池、电池及其他装鼍组成。

        （二）基本原理 核酸化学合成法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备。在基 因的化学合成中，通常是先合成一定长度的、具有特定序列的寡核苷酸片段。寡核苷酸片段 的化学合成方法主要右磷酰二酯法、磷酰三酯法、亚磷酰胺三酯法，以及在后者基础上发展 起来的周相合成法和自动化法。目前，核酸化学合成的主流方法是亚磷酰胺三酯法，它的原 理是将单核苷酸按既定序列依次加到共价耦联于二氧化硅型固相载体的核苷酸链上，而末连接上的过量反应试剂、单体及副产物则一律被洗脱。

        二、聚合酶链反应核酸扩增仪器 聚合酶链反应( PCR)又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新。它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品，此方法在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛 应用。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点，已在病原微生物学领域中显 示出广阔的发展前景。

        （一）基本结构 聚合酶链反应(PCR)仪按变温方式可将其分成三类，即变温铝块式、水浴式及变温气流 式。变温铝块式热源用电阻丝、导电热膜、热泵式珀尔帖半导体元件制作，让带有凹孔的镉 块升温，用自来水、制冷压缩机或半导体降温。水浴式有三种不同温度的水浴，用机械装置将带有反应管的架子移位和升降湿度，作温度循环。变温气流式依据空气流的动力学原理，以冷热气流为介质升降温度。

        （二）基本原理 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法，类似体内半保留复制过程，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三步骤反复的热循环构成。每一次循环所产生的DNA均能成 为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增1倍，PCR产物得以以2n的指数形式迅速扩增，经过25-30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106~107倍。PCR反应的五个要素为模板(或样品DNA)、引物(primer)、耐热DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和镁离子（Mg2+），其中关键步 骤是佳引物的设计。

        三、DNA序列测定仪器
        DNA的序列分析是分子生物学研究中进一步研究和改造目的基因的基础，随着分子克 隆技术的日臻完善，DNA序列测定的简便方法和仪器设备应运而生，DNA序列测定也从手 工测定逐步发展到半自动和全自动分析。

        （一）基本结构 DNA序列测定仪基本构造包括电泳装置和高压电泳仪，全自动DNA测序仪带有自动 检测系统的高压电泳装置，使用过程是标本经PCR反应后，样品可自动加样到凝胶中进行 电泳。在高压电场的作用下，DNA片段依其分子大小依次穿过凝胶板下端的检测区。检测 系统在电泳过程中实时进行信号扫描采集，检测窗口有激光器发出的光束，激光束以与凝胶板垂直的方向射向凝胶，在凝胶中电泳的DNA片段上的荧光基团吸收激光束提供的能量 而发射出特征性波长的荧光，该荧光被一个灵敏度极高的光电管检测并转化为电信号，这些 信号传人计算机储存。计算机将其收集到的荧光信号的波长、强度、空间生标等建立一个多维矩阵数据库，其软件以该数据库为基础模拟显示电泳分离后的DNA排列网像并自动读出DNA序列。

        （二）基本原理 核酸序列分析的关键是，用凝胶电泳技术按大小把各种不同长度的核酸片段有序地分离开并显示出来。核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，在弱碱性条件下带负电荷，在电场中向正极移动，核酸分子的移动速度取决于核酸分子本身的大小和构型，分子结构紧密的 DNA比同等分子量的松散型DNA或线型DNA分子泳动速度快。同一分子在不同的构型情况下，其泳动速率也有差别。因此，测序时必须使核酸分子在完全变性的条件下电泳，才 能保证核酸分子在凝胶中的迁移率与分子大小有关。

        1. Sanger法利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺人一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有 四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。 由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在标记处终 止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基曲链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X线胶片放射自显影或非放射性核素标记进行检测。

        2．Maxam-Gilbert化学降解法利用一个末端标记的DNA片段在五组互相独立的化 学反应中分别得到降解，其中每一组反应特异地针对某一种碱基，因此生成五组标记分子， 每一组混合物中含有长短不一的DNA分子，其长度取决于原DNA片段上的位置，通过电 泳检测其序列。

        四、生物芯片及相关仪器生物芯片叉称生物集成膜片，其概念源自计算机芯片，它是分子生物学技术与汁算机技术等相结合而发展起来的一项分子生物学技术。它是将生命科学研究中所涉及的许多分析 步骤，利用微电子、微机械、化学、物理技术、传感器技术、计算机技术，使样品检测、分析过程 连续化、集成化、微型化。它是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR技术后的叉一次革命性技术突破。 生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化。芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列，能够在短时间内分析大量的生物分子，使人们快速准确地获取样品巾的生物信息，效率是传统检测手段的成百上千倍。它将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。 常见的生物芯片分为三类：基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室，应用晟广泛的生物芯片是基因芯片。与生物芯片相关的仪器主要有点阵仪、杂交仪和扫描仪。

        （一）点阵仪
        点阵仪是制备芯片的仪器。点样的方式有非接触喷点和接触点样两种，点阵仪点样针采用实心或空心中的一种。

        1．非接触喷点技术用于DNA点样的有2种，一种是用压电晶体将液体从7L中喷出 的压电技术，喷滴大小一般为50~500pl;另一种为注射器螺线管技术，这种技术是通过高 分辨率注射器泵和微螺线管阀门有机结合未精确控制液滴。喷点的好处在于分注体积可 控，分注机制与表面特性无关，对脆弱表面不会造成损伤，无来自表面的污染，适用于有孔表面（如膜）的点样。

        2．接触喷点技术是通过针点印制完成的，这种方式是用较为坚硬的针头浸到样品 中，蘸取少量液体，当针头与固相表面接触时，液体会印制在玻片表面，点样体积从皮升到纳升。

        （二）杂交仪
        杂交是生物芯片操作过程中的关键部分，杂交的成败决定生物芯片的质量。目前大多 数情况下，杂交均在保湿盒内完成，使标记探针只能通过扩散作用进行杂交，反应极慢且操 作时间长。 GeneTAC Hby生物芯片杂交仪是一种全自动的芯片杂交仪，调节、加探针、漂洗和热 循环自动化，杂交在密闭环境进行，一次可以杂交2片或12片，多可设置5种不同的洗涤液。该系统在整个杂交过程中能精确地控制温度。液体处理使用真空输送系统结合高精度微流体通道，洗涤时间和热循环条件精确控制，使每片之间和每日之间的杂交重复性。 杂交仪能进行原位振动，加快反应动力学并防止部分区域干涸，保证mRNA在杂交过程中的流动，提高了灵敏度。

        （三）扫描仪
        芯片杂交后荧光的观察可以通过CCD直接成像分析或激光共聚焦扫描仪分析结果。

        1.直接成像系统其澈发光源一般为过滤的光谱（钨或弧光灯）光源，照射整张玻片，高灵敏度的CCD摄像头与合适的光学器件和滤光片相配。优点是其配置简便和数据获取快速．缺点是空间分辨率低和灵敏度差。

        2．激光共聚焦扫捕仪用共聚焦荧光显微镜通过物镜将激光发射至玻片，并通过同一物镜扫描玻片收集诱发的荧光，物镜上方的二色镜可以同时检测到两种波长的诱发荧光。 扫描系统的优点是高灵敏度和高空间分辨率，缺点是系统需要复杂的固定装置，来提高扫描准确度。