微信公众号 联系我们 关于我们 3618客服热线:020-32784919   推广热线:020-32780069
资讯
频道
当前位置:首页 > 医疗器械资讯 > 新品动态 > 研究人员对 “CRISPR 基因组编辑如何工作” 进行全原子模拟

研究人员对 “CRISPR 基因组编辑如何工作” 进行全原子模拟

文章来源:生物通发布日期:2017-01-13浏览次数:1026
在过去的十年里,谈论多的生物学突破就是,基因组编辑工具 CRISPR/Cas9 的发现,它能够修改 DNA,并可能在根本上消除许多遗传性疾病的根源。
 CRISPR 相关蛋白 9(CAS9),初发现是作为化脓性链球菌细菌免疫系统的一部分,在其原生状态,可识别外源 DNA 序列和抑制它们。
 在细菌中,该系统被用于靶定来自噬菌体的外源病毒 DNA——这些 DNA 在其进化历史中已被为是敌人,并将一个记录整合到自己的 DNA 中。
 CRISPR 表示包含短重复碱基序列的 DNA 片段,重复序列后面是来自以前暴露外源 DNA 的 “间隔 DNA” 短片段。该复合体包括解开 DNA 的蛋白质,以及能够识别细胞中敌方 DNA 的向导 RNA。
 研究这一古老免疫系统的研究人员认识到,通过改变向导 RNA 序列与给定靶标匹配,它不仅可以用来切割病毒 DNA,而且可以在精确选择的位置切割任何 DNA 序列。此外,新的 DNA 片段可以被引入到新的切割部位。
 该方法首先是由加州大学伯克利分校的 Jennifer Doudna 和瑞典于默奥大学的 Emmanuelle Charpentier 构思和开发出来的,已用于培养细胞——包括 STEM 细胞,和受精卵,来制备具有靶向突变的转基因动物,有助于研究基因功能。CRISPR/Cas9 可以同时影响许多基因,从而可治疗涉及多基因相互作用的疾病。延伸阅读:CRISPR 先驱获得新突破:开发更安全的 CRISPR-Cas9 基因疗法。
 该方法正在迅猛发展,预计有一天可应用在基础研究、药物开发、农业和治疗人类遗传性疾病患者中。
 然而,产生靶向的 CRISPR/Cas9 基因突变在目前是昂贵和费时的,特别是对于大型的研究来说。这个过程也容易出错,从而限制了它的广泛使用。这些问题部分是由于我们对于 “CRISPR/Cas9 在分子水平上是如何工作的” 缺乏充分的了解。
 在 2016 年十一月,来自北得克萨斯大学(UNT)一个以 Jin Liu 为首的研究小组,采用德克萨斯计算中心(TACC)的 Maverick 超级计算机,对 Cas9 催化的 DNA 裂解作用进行了全原子分子动力学模拟。
 相关模拟结果发表在《Scientific Reports》杂志,揭示了 Cas9 基因组编辑的过程。他们还帮助解决了关于 “切割的特定方面” 的争议:例如,编辑发生的精确部位以及 Cas9 是否产生钝端或交错末端的裂解。
 Liu 说:“现在,在如何将这项技术用于治疗上,存在相当多的问题。酶的特异性和效率不高。将酶传递到基因编辑的位置也很困难。要解决这些问题,首先,我们需要知道这种酶是如何工作的。我们的研究为 Cas9 机制的理解,提供了基础。”
 以前,科学家们通过 X 射线晶体学确定了 Cas9 在活动状态时的结构,但是基因编辑过程发生的如此之快,没有哪种实验技术可以捕捉它的状态变化,并确定它是如何工作的。

图片来源网络
 利用分子动力学模拟——通过模拟固定时间内大量原子间相互作用来研究分子动力学的方法,Liu 和 UNT 的合著者 Zhicheng Zuo,能够在飞秒时间分辨上观察到 Cas9 酶中的变化,并捕获到系统活跃状态的过渡。
 这些模拟包括 Mg2 + 离子,它们被认为可诱导 Cas9 的构象变化,从而它能发挥作用。研究人员推测,Mg2 + 离子可通过促进 Cas9 位点和 DNA 的接近,诱导到一个活跃状态的构象变化。
 Liu 和 Zuo 在 Maverick 上运行的模拟,包含 280000 个相互作用的原子。根据 Liu 介绍,具挑战性的部分在于,有效地采集构象空间来定位活动状态。
 Liu 说:“我们尽力提高我们模拟结果的可靠性。我们做了几个长 200 和 300 纳秒的轨迹,也做了几个短的 60 纳秒的轨迹,以确保我们有一致的结果。对于每次配置,我们进行了至少六次并行模拟。”
 除了研究 CRISPR/Cas9 复合物如何变成它的活性状态,这些模拟揭示了它在哪里剪切 DNA。
 UNT 药学助理教授 Liu 说:“通常人们认为,它是在一个位置上切割,但没有明确的证据表明。使用我们的计算方法,我们确定了切割发生在另一个位置,这可能意味着,这种酶可以一种更可控的方式切割 DNA。因此,通过做这项工作,我们为设计更有效的酶——可以一种更具体的方式切割 DNA,打开了新的途径。”
 他们终的结果回答了 “基因组编辑是否产生钝端或交错端” 这个悬而未决却有着实际意义的问题。
 CRISPR/Cas9 切割双链 DNA 的两半。如果它在两条链的同一位置上切割,就会产生钝的端部;如果它在略有不同的位置切割,就会产生交错的端部。他们的模拟结果表明,CRISPR/Cas9 创建了交错末端。
 她说:“这对于基因编辑将是非常重要的,因为交错端 DNA 比钝端 DNA 更加可控。”
 UNT 医药科学主席 Iok Hou Pang,利用 CRISPR/Cas9 在他的实验室做实验性眼科研究。对于他当前和未来的研究,他看到了 “更深入了解这种酶的行为” 的价值所在。
 Pang 说:“我的实验室一直使用 CRISPR/Cas9 基因编辑系统,来敲除培养小鼠视神经星形胶质细胞中的一个新蛋白。Liu 博士的工作将帮助我们了解这个酶系统和它底物之间的分子相互作用,并终有助于提高其效率,对于这种奇妙的分子技术来说这是非常有用的。”
 2015 年,在美国国家科学院的主持下,全球科学家宣布禁止利用 CRISPR/Cas9 来编辑人类基因组,然而有迹象表明,研究人员已经打破了这一禁令。他们说,我们对该过程和这样做的长期影响知之甚少。但是像 Liu 这样的研究,将来可能会对 “调整这些工具并使它们可用于人类” 发挥一定的作用。
 Liu 说:“我们试图理解基因组编辑酶的机制,这可能对未来的药物和治疗应用有很大的潜力,可以让我们更接近于将这种技术用于人类疾病治疗。没有 TACC 资源,这项研究将无法完成。”
 论文原文:Cas9-catalyzed DNA Cleavage Generates Staggered Ends: Evidence from Molecular Dynamics SimulationsAbstract:The CRISPR-associated endonuclease Cas9 from Streptococcus pyogenes (spCas9) along with a single guide RNA (sgRNA) has emerged as a versatile toolbox for genome editing. Despite recent advances in the mechanism studies on spCas9-sgRNA-mediated double-stranded DNA (dsDNA) recognition and cleavage, it is still unclear how the catalytic Mg2+ ions induce the conformation changes toward the catalytic active state. It also remains controversial whether Cas9 generates blunt-ended or staggered-ended breaks with overhangs in the DNA. To investigate these issues, here we performed the first all-atom molecular dynamics simulations of the spCas9-sgRNA-dsDNA system with and without Mg2+ bound. The simulation results showed that binding of two Mg2+ ions at the RuvC domain active site could lead to structurally and energetically favorable coordination ready for the non-target DNA strand cleavage. Importantly, we demonstrated with our simulations that Cas9-catalyzed DNA cleavage produces 1-bp staggered ends rather than generally assumed blunt ends.