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去卵巢小鼠大脑组织中Bcl-2和Bax表达的变化

文章来源:基础医学与临床发布日期:2017-04-19浏览次数:492

目前绝经综合征的治疗主要是激素替代治疗( hormone replacement therapy,HRT)。HRT的关键是补充雌激素。大规模流行病学调查显示,女性绝经后神经退行性疾病发病 率明显增高,其中女性阿尔茨海默病( Alzheimer's disease, AD)发病率为男性的2~3倍。女性AD患者脑中雌激素水平较正常老年女性低,HRT能降低妇女AD的危险性及延缓AD的发生,改善认知功能[1]。凋亡是神经退行性疾病的重要病理特征。本实验检测小鼠更年期模型大脑中重要 凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达,以及补充雌激素后的变化。

1材料与方法

1.1材料
1.1.1实验动物:清洁级8周龄C57雌性小鼠40只,体质量18—21 g[北京,斯贝福,SCXK(京)2011-- 0004]。

1.1.2主要试剂:Bcl-2、Bax和β-actin(Santa Cruze公司);羊抗兔IgG、免疫组化试剂盒SP-0023(博奥森公司);山羊抗小鼠IgG(碧云天生物公司);β-Estradio(Sigma公司)。

1.2方法
1.2.1分组及处理:将小鼠随机分为对照组( control)、假手 术组( sham)、去卵巢组(Ovx)和雌二醇组(OVXE)。OVX和OVXE组切除双侧卵巢。术后6周,OVXE组皮下注射雌二醇(参照《绝经过渡期和绝经后HRT临床应用指南》确定为0.5 mg/kg,隔日),给药2周,取大脑组织,左右半球随机分开,一半用于免疫组化,一半留作Western blot。

1.2.2免疫组化:按试剂盒说明操作。各样本取5张切片,取5个视野计阳性细胞数,取平均值。 1.2.3 Western blot:50 μ蛋白样品行SDS-PAGE电泳。转膜采用恒压60 V湿转,封闭;一抗(均按1:200稀释)4℃过夜,洗膜;二抗(1:1 000稀释)37 cc孵育1 h;洗膜;ECL发 光。Gel-pr04.O软件分析条带,重复3次。

1.3统计学分析:采用SPSS16.0软件进行统计,单因素方差分析各组间差异,计数资料用均数±标准差(x+s)表示。

2结果
2.1免疫组化结果:与sham组比,OVX组表达Bax阳性细胞数增多(P< 0.01),表达Bcl-2阳性细胞数减少(P<0. Ol)。与Ovx组比,OVXE组表达Bax阳性细胞数减少(P<0.01),表达Bcl-2阳性细胞数增多(P<0.01)(表1)。

2.2 Western blot结果:与sham组比,OVX组Bax表达增高(P<0.01),Bcl-2表达降低(P<0.01),Bcl,2/Bax比值明显降低(P<0.01)。与Ovx组比,OVXE组Bax表达降低(P<
0.05),Bcl--2表达增高(P<0.05),Bcl-2/Bax比值增高(P<0.05)(图l,表1)。


3讨论

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中重要的凋亡相关蛋白。Bcl.2家族通过调节线粒体内膜结构的通透性调控细胞的凋亡。其中Bax在线粒体外膜上形成Bcl- 2/Bax和Bcl-xl/Bax异二聚体,维持线粒体外膜的完整。Bax同二聚体能构成跨线粒体外膜的线粒体通透性转换孔,导致线粒体膜电位降低,细胞色素C等外流,终诱导细胞凋亡[2]。Bcl-2能封闭Bax形成孔道的活性,使一些小分子物质不能自由通透,Bcl-2还能将Apaf-1等定位到线粒体膜上,抑制其发挥作用[3]。实验中,更年期模型小鼠大脑中Bax表达增高,Bcl-2表达降低;补充雌激素后Bax表达降低,Bcl-2表达增高。这与目前雌激素可能是通过线粒体功能的调节来实现对脑的保护作用的观点是一致的。

[ 1 ] Arevalo MA, Azcoitia I, Garcia-Sequra LM. The neuroprotective actions of oestradiol and oestrogen receptors[J] . Nat Rev Neurosci, 2015, 16:17-29.
[2] Veqa N, Cunha 0, Serafim TL, et al. Analysis of pro-apoptotic protein trafficking to and from mitochondria [ J].Methods Mol Biol, 2015, 1241:163-180.
[3]焦俊霞,高维娟,李玉明,等.黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Bcl-2和Bax表达的影响[J].中国病理生理杂志,201 1,27:905 - 910.