热休克蛋白90仪功能性基因序列过表达慢病毒载体的构建和鉴定

 我们利用基因工程技术构建热休克蛋白90a（Hsp90a）功能性基因F-5的过表达慢病毒载体，并体外转染以检测其表达的准确性，为下一步研究F-5多肽对组织的重建修复奠定实验基础。
一、材料与方法

1．材料：(1) GV358载体：元件顺序为Ubl-MCS-3 FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin；(2)引物：上游引物(F)：5’-GAGGA-TCCCCGGGTACCGGTCGC CACCATGGAAGAAAAGGAAGAC AAA-
G-3’；下游引物(R)：5’-TCCTTGTAGTCCATACCATCAAAAGGA-GCACGTC-3’。
2．实验方法：(1)聚合酶链反应(PCR)扩增F-5基因片段；(2)酶切GV358载体并将F-5基因片段连接至线性化的GV358载体上；(3)运用PCR方法鉴定阳性克隆的F-5 -GV358载体：(4)重组慢病毒转染293T细胞，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白( GFP)表达；(5)Westem blot检测目的基因的表达。
二、结果
1．成功扩增了F-5基因片段并顺利连接到了GV358载体上。
2．通过测序鉴定了F-5-GV358质粒构建正确。
3．重组慢病毒载体能够转染细胞并表达F-5、GFP。
三、讨论
Cheng等[1]发现Hsp90ct结构中一段含有1 15个氨基酸的多肽F-5，比全长的Hsp90a在创面中更快促进创面愈合。本实验的慢病毒过表达载体利用Flag标记F-5，GFP可有效示踪载体细胞在活体内的迁移，嘌呤霉素可筛选出转染成功的载体细胞，为进一步研究F-5修饰干细胞在创面愈合过程中的作用奠定了实验基础。