病原体宏基因组测序未来？一文了解新进展

微生物诊断技术

传统的微生物诊断技术包括使用培养物（介质和琼脂）、病原体相关抗体的血清学检查，以及采用PCR技术对微生物遗传物质（DNA 或 RNA）进行检测。然而，这些技术存在较大的应用范围限制。通过使用特定的培养条件、抗原或引物，只能检测到一部分病原体。此外，有些技术方法（如微生物培养）敏感性较低，无法捕获微生物负载较低的微生物，或不适用于无法进行体外培养的微生物。 为了克服这些挑战，人们对于使用宏基因组学技术来分析患者样本中的 DNA/RNA 信息越来越感兴趣，这些信息包括全微生物组信息，以及人类宿主基因组或转录组信息1。以宏基因组学为技术开展鉴定分析其实早有先例，并已广泛应用于环境样本和法医样本的特征鉴定。 本文将重点解释如何使用宏基因组学方法来加强传染病监测，以及如何获得临床稳健性。

宏基因组学在传染病监测中的应用 目前，宏基因组分析法采用的是下一代测序（NGS）技术。相比微阵列技术，NGS 的通量更高。NGS 技术在单次运行中可产生数百万次到数十亿次的序列，以对临床样本进行全面分析。而且，NGS 还因降低了成本而备受赞誉。基于上述优势，NGS 已成为宏基因组学的主要技术，并在识别抗生素耐药性2和传染病暴发的原因方面发挥了关键作用3。 宏基因组下一代测序（mNGS）的典型工作流程如下：首先，提取总核酸（DNA 和 RNA）。其次，将 RNA逆转录成互补 cDNA。随后，使用 Illumina 和 Oxford Nanopore Technologies 等公司的仪器对 DNA 和 cDNA 进行测序，并将其比对至参考基因组中，以确定其中所存在的微生物种类以及相对数量。 若要提高对低数量级病原体的检测灵敏度，可在探针捕获富集核酸的步骤中加入磁珠。 与 mNGS 相比，分子 PCR 诊断方法具有明显的成本和时间优势，如 mNGS 测序周期近 20 小时，而后者仅需 2 小时左右。不过，mNGS 也有其独特优势，如检测范围更广，可根据可识别 DNA 或 RNA 序列，直接从临床样本中识别出病毒、细菌、真菌和寄生虫等病原体4。 此外，mNGS 数据还可以与其他表征技术（包括人类宿主反应的 RNA 测序技术）相结合，以更好地了解疾病的进展以及患者对病原体和疗法的反应。 我国研究人员利用 mNGS 诊断方法来检测社区获得性肺炎（CAP）。引起 CAP 的病原体或涉及 100 多种病毒、细菌、真菌和寄生虫5。但是由于对罕见病原体的诊断数据缺乏，加之苛养菌的培养难度高，仍有高达 62% 的 CAP 病例无法诊断出来。 该团队共招募了 159 名患者：100 例样本用常规培养技术进行检测，其余 59 例则使用 mNGS 诊断技术进行检测。两个研究组别在多项健康指标上无统计学差异。结果表明，mNGS 能够检测到的病原体范围更广。

具体而言，mNGS 检测出了 179 种病原体（其中细菌 113 种，真菌 32 种，病毒 34 种），相比对照组所检测出的 105 种病原体（细菌 78 种，真菌 27 种），多了近 70%。

这是 mNGS 诊断技术的一大关键优势，因为超过 50% 的 CAP 阳性患者存在细菌、真菌和病毒的混合感染。重要的是，数据表明，mNGS 检测组的疾病缓解率（63%）高于对照组（7%），医院死亡率更低（8.6% VS 26%），这是由于 mNGS 诊断结果的准确性带来了治疗方案的改变。尽管 mNGS 在传染病监测方面很有前景，但仍面临不少挑战。例如，通常而言，非人类遗传物质的序列仅占<1%。因此，检测的灵敏度在很大程度上取决于宿主基因组物质背景的情况。一般来说，无细胞液体样本比组织样本具有更高的灵敏度。此外，定义非无菌样品中的微生物种群也具有挑战性，因为其中或存在环境微生物污染。

更快且成本更低的工作流程

mNGS 的另一局限之处在于，该过程至少需要 20 个小时，甚至可能长达数日，其中涉及的过程包括核酸提取和 RNA 逆转录等多个步骤。此外，由于 mNGS 对人力的需求高以及消耗性成本高，也使其无法用于资源匮乏地区的传染病监测。 为了克服这一问题，上海公共卫生临床中心的研究人员创建了一套简化版临床宏基因组测序方案。该团队采用离液盐基缓冲液，结合珠磨破碎法来增强裂解和 DNA 的提取效果，随后建立 Illumina 测序文库。在这一实验过程中无需昂贵的核酸提取试剂盒，也不需要其他步骤如样品预处理、去除宿主和病原体富集等。 整个过程（20个样本）耗时约 8 小时，对乙肝阳性血清和甲型流感病毒库等类型的样本覆盖率。这一高覆盖率对于将测序 DNA 映射到已知参考基因尤为重要。甲型流感样本被连续稀释 10000 倍后，虽然覆盖率会因此降低到 26%，但依然可以在低病毒载量下对病毒进行可靠识别。 之后，研究团队将 mNGS 工作流应用于临床样本，其中包括脑膜炎/脑炎患者的 20 个脑脊液样本，这些患者的大脑/脊髓存在微生物感染。测序过程中发现有样本中存在刚地弓形虫序列，随后再次取样开展抗体检测，结果确呈阳性。 从简化版 mNGS 获得的研究结果来看，工作流程经优化后，DNA 提取和变性效率得以提升，但仍具有与传统 mNGS 同样的灵敏度，并且可以实现以更低成本提供高通量诊断。 上海市公共卫生临床中心首席研究员、堪培拉大学副教授张小楠博士说：“临床宏基因组测序作为一种无偏识别病原体的诊断工具，除了研究用途外，也越来越多地应用于临床。然而，如果要在资源匮乏的国家应用这项技术，那么仍需要进一步降低流程复杂性和总成本。”

克服假阳性

血液感染会导致败血症和感染性休克，与高发病率和高死亡率密切相关。而 mNGS 方法可以提高病原体识别效率，从而对症下药，同时可以帮助我们理解为何患者对不同疗法的疗效有差异。 尽管 mNGS 在血液病原体检测方面成效好，但由于标本采集过程中所伴随的污染，尤其是来自实验室试剂和环境中的人源菌群和背景微生物，使得 mNGS 诊断结果仍存在很高的假阳性率6。 北京大学人民医院的研究人员试图通过将多个对照组数据作为数据过滤器来克服 mNGS 的高假阳性率。该研究设立了三个对照组：阴性样本对照组、健康人群样本对照组和经长期监测以识别常见微生物污染物的外部阴性对照组。为了过滤掉一些由亲缘关系度高的类群带来的假阳性干扰，该团队还引入了两个标记物。 这一改进的系统可提供与血液培养相类似的灵敏度和特异性，不过需要几天的时间，也不能用于检测苛养菌。值得注意的是，改进后的系统在检测真菌病原体方面优于其他临床方法。 然而，该系统未能在 12 个样本中检测到血液感染。对此，作者解释说，这可能是由于在感染的早期阶段，细胞游离 DNA 的可提取性较低，以及过滤器的严格程度问题。他们也提出进一步假设，如果用更多的阳性和阴性样本来改进过滤器，那么这一方案能呈现出来的检测性能或将进一步提升。

加强跨机构合作

这一领域看似很有前途，但 mNGS 结果受限于独立实验室、实验协议和工作流程，以及参考标准。这就导致了，如果医疗保健机构在执行传染病暴发监测等任务时，希望对比不同地区的监测数据，这一需求变得极具挑战性。 中国食品药品检定研究院（北京）的研究人员主导了一项多中心评价项目，由17个独立实验室共同使用一套通用的参比试剂和性能指标，来比较 mNGS 检测结果。研究人员希望这一工作可以在建立性能标准、指导结果解释、推动试验和工作流程开发、提高合规审批通过率方面带来新的机会9。 为了模拟中枢神经系统的感染，该团队构建了一组参考试剂，包含 9 种病原体，覆盖 30 种以人类宿主细胞为生存背景的微生物。其中部分细菌种类具有一定的亲缘关系，这是为了确定其是否会被 mNGS 方法识别出来。 为了确定检测的动态范围，研究人员所采用的微生物的基因组大小和GC含量较为广泛，其中基因组大小从0.7Kb 到 19.05Mb，GC 含量从 33.2% 到 70.4%。同时，也采取了一系列策略以提高检测结果，包括消耗宿主细胞策略和使用污染物过滤器。 测试结果的平均运行时间约为 24 小时，其中测序步骤耗时久。因此，作者建议读取长度为 75 个碱基对（或更少），从而使宏基因组分析更高效。作者还表示，希望随着更高基因组覆盖率的产生，可以开发出更为复杂的识别算法，届时，mNGS 或将具有更为强大的数据特异性，并有可能成为合规或技术标准建立的一种手段。 中国食品药品检定研究院刘东来博士说：“我们所做的工作可以说是鸟枪法宏基因组学在病原体检测领域全面的基准研究，包括对其可靠性、关键性能决定因素、可重复性和量化潜力进行评价。这项工作为临床和监管机构的技术评估提供了一个包含近 6000 亿次读取（>5Tb）的独特资源。我们相信，我们的多中心分析项目对于推动鸟枪法宏基因组学相关实验技术的进一步发展和生物信息学工具的进一步开发而言，十分有价值。”

未来发展

传染病仍然是世界上大的死亡原因之一。然而，随着监测技术的进一步优化，或可通过及早发现病原体，从而挽救更多的生命。 虽然 mNGS 技术仍存在运行时间长、灵敏度低等局限性，但不可否认的是，这是一种比培养法更为可靠的病原体检测方法。此外，与分子 PCR 诊断技术相比，mNGS 诊断方法覆盖的病原体更为广泛，经证实，也可用于识别多种病原菌合并感染的鉴定。 随着样本处理方法、假阳性信号过滤算法以及跨机构算法差异的改进，mNGS 诊断技术有望在传染病的临床监测中发挥越来越重要的作用。