肠道菌群通过PUFA相关神经炎症调节阿尔茨海默病的病理和认知障碍

本研究旨在调查肠道生态失调在大脑炎症中的作用及其对阿尔茨海默病(AD)发病机制的贡献。本研究以年龄依赖性方式分析了3×Tg小鼠的肠道微生物群组成。生成了无菌3×Tg小鼠，并使用AD患者和年龄匹配的健康供体粪便样本对无菌3×Tg小鼠进行了再定植。微生物16S rRNA测序显示拟杆菌富集。与SPF小鼠相比，GF 3×Tg小鼠的大脑淀粉样蛋白β斑块和神经原纤维缠结病理明显减少。海马RNAseq显示，在没有肠道微生物群的情况下，3×Tg小鼠大脑中的炎症通路和胰岛素/IGF-1信号通路发生异常改变。代谢组学分析鉴定出多不饱和脂肪酸代谢产物及其氧化酶选择性升高，对应小胶质细胞活化和炎症。与健康供体的微生物群移植相比，AD患者的肠道微生物组加剧了3×Tg小鼠的AD病理，与C/EBPβ/AEP途径激活和认知功能障碍相关。综上所述，这些结果支持复杂的肠道微生物组是行为缺陷、小胶质细胞活化和AD病理所必需的，肠道微生物组有助于AD小鼠模型的病理，人类微生物组的生态失调可能是AD的风险因素。

结果

1 肠道微生物刺激了3×Tg小鼠的AD病理、认知缺陷和小胶质细胞活化

作者报道了老龄3×Tg小鼠的微生物群通过激活大脑中C/EBPβ/AEP信号通路加速了年轻3×Tg小鼠的AD病理，表明年龄依赖性微生物组的变化会影响AD病理。因此，微生物组组成的纵向研究对于发现影响宿主的微生物群落的变化是必要的。为了鉴定微生物群中促进AD小鼠模型中生理或病理生理反应的时间特征，我们利用3×Tg AD小鼠模型通过高通量测序分析生成了17个月的16S rRNA基因谱的时间序列。微生物组分析显示，4、8、12和17月龄3×Tg小鼠的微生物组成存在不平衡。此外，主坐标(PCoA)分析表明，3×Tg小鼠的微生物群与年轻野生型小鼠的微生物群明显聚集。在门水平上，与4月龄WT相比，4、12和17月龄3×Tg小鼠中变形菌门的相对丰度增加。另一方面，厚壁菌门和蓝藻的相对丰度逐渐降低，而8月龄和17月龄3×Tg小鼠中拟杆菌门的相对丰度则高于4月龄3×Tg小鼠。厚壁菌门的减少和拟杆菌门的增加与炎症和不同疾病有关。此外，粘蛋白降解和诱导炎症的瘤胃球菌物种在老龄3×Tg小鼠中的相对频率增加。简而言之，微生物组分析表明，老龄3×Tg小鼠体内的微生物群发生了改变，其特征是有益抗炎细菌群落减少，随后肠道促炎致病菌富集。

为了阐明肠道微生物群在AD发病机制中的作用，我们将GF重新衍生为3×Tg AD小鼠模型。平均而言，GF小鼠体重比同龄SPF小鼠轻。此外，由于肠道微生物组缺失，GF小鼠表现出盲肠增大，体重增加，盲肠内容物呈深色，尽管它们的胃肠道长度仍与SPF小鼠相当。GF小鼠粪便样本的无菌状态通过细菌培养物进一步验证，细菌培养物未显示可证明的细菌。与SPF 3×Tg小鼠相比，GF小鼠皮层中Aβ聚集物沉积和ThS(硫黄素S)免疫荧光(IF)共染色信号降低。此外，与SPF小鼠相比，用特异性T22单克隆抗体验证的海马过度磷酸化tau(AT8)和纤维tau包涵体也减少。定量显示，与SPF小鼠相比，GF小鼠中的Aβ42(而非Aβ40)减少(图1C)。这些观察结果表明，当肠道微生物群耗尽时，AD病理得到缓解。

尽管两组小鼠大脑中BDNF水平相似，但高尔基染色显示，与SPF小鼠相比，GF小鼠海马神经元中的树突棘升高。同时，在Y迷宫中的行为表明，GF小鼠的空间记忆功能明显优于SPF小鼠。小胶质细胞的成熟和激活与AD大脑的慢性神经炎症有关。在GF小鼠的皮层小胶质细胞中，Iba-1染色显示出直径、分支和节点数量增加。小胶质细胞的半自动定量形态测量三维测量显示，与SPF小鼠相比，GF小鼠的这些小胶质细胞形态发生了变化。因此，肠道微生物群促进AD病理、认知缺陷和小胶质细胞激活。

2 肠道微生物激活C/EBPβ/AEP途径，升高与PUFA代谢有关的促炎酶

我们的研究支持C/EBPβ/AEP信号通路在时空上调控AD病理。为了评估是否需要完整的肠道微生物组来刺激这一途径，从而促进AD的发病，我们进行了免疫印迹分析，发现与SFP小鼠相比，GF 3×Tg小鼠大脑中的C/EBPβ/AEP信号减弱。随后，AEP截短的tau N368和APP N585片段减少，与p-tau AT8和AT100活性降低相关。值得注意的是，与SPF小鼠相比，GF 3×Tg小鼠的Lox5，Cox1和Cox2水平明显降低，这与先前的研究结果相吻合，即AA代谢途径不仅是炎症的核心网络，也是工作记忆障碍导致AD发病的主要原因。正如预期的那样，蛋白酶检测显示GF小鼠的AEP酶活性低于SPF小鼠，与活性AEP水平降低一致。由于C/EBPβ是IL-6的主要转录因子，因此，与SPF小鼠相比，GF小鼠中的IL-6浓度降低。qRT-PCR结果显示，与SPF小鼠相比，GF小鼠的CEBPβ靶标/AA通路基因略有降低(与RNAseq数据相对应。然而，qRT-PCR数据没有统计学意义，这可能是由于定量PCR(qPCR)分析的差异较大所致。

脑切片IF共染色显示，GF小鼠与SPF小鼠相比海马和皮层中C/EBPβ上调、AEP激活、Aβ积累、Tau N368片段化和p-Tau(AT8)减少，与GF小鼠中C/EBPβ/AEP信号减弱以及APP N585和Tau N368片段减弱一致。此外，GF小鼠大脑中5-Lox，Cox1和Cox2的IF活性明显降低，与C/EBPβ信号减弱密切相关。因此，与SPF小鼠相比，GF小鼠的C/EBPβ/AEP信号和AA相关炎症酶减少，这表明肠道微生物群通过激活C/EBPβ/AEP途径调节这些效应因子的表达。这些结果与先前的报道一致，即C/EBPβ作为这些AA相关炎症酶的转录因子发挥作用。免疫组化(IHC)染色进一步证实，与SPF小鼠相比，GF小鼠大脑中的Iba-1和AEP均降低，与皮层中Iba1和AEP IF共染色一致。因此，GF 3×Tg小鼠表现出C/EBPβ/AEP通路减弱和AA相关炎症减弱。

3 肠道菌群提高炎症代谢物并改变大脑中的炎症和胰岛素/IGF-1通路

为了评估肠道微生物组对AD相关转录反应的整体影响，我们使用GF和SPF 3×Tg小鼠的海马样本进行了无偏RNA测序，并通过RNA转录本的定量深度测序测量了全基因组mRNA表达谱。我们发现SPF和GF动物之间的mRNA谱和整体基因表达模式存在差异。通过主成分分析(PCA)对数据集中的主要方差来源进行评估，显示GF和SPF 3×Tg小鼠之间明显分离。我们观察到SPF 3×Tg小鼠与GF 3×Tg小鼠的1872个差异基因。在差异表达基因中，与GF 3×Tg小鼠相比，我们在SPF 3×Tg小鼠的海马中观察到载脂蛋白E的表达下调。接下来，利用GF和SPF 3×Tg小鼠之间海马区差异表达基因，通过功能mRNA的聚类分析生成热图。值得注意的是，与GF 3×Tg小鼠相比，参与AA代谢途径的基因，包括Hpgd、Ptges3、Ptges2和Cyp1b1，在SPF 3×Tg小鼠中差异表达(上调：Hpgd、Ptges3和Cyp1b1;下调：Ptges2)，这与我们的观察结果相吻合，许多AA相关炎症酶在GF小鼠中明显减少。有趣的是，除了AA代谢途径中改变的促炎基因外，RNAseq还显示，与GF小鼠相比，SPF小鼠的胰岛素信号及其相关的下游通路发生了异常改变。因此，我们通过免疫印迹检测海马胰岛素信号，发现与SPF小鼠相比，GF小鼠的p-胰岛素受体(IR)和p-IRS(IR底物)及其下游效应物(包括p-Akt和p-MAPK和p-GSK活性)均增加。这些数据与先前的报道一致，即AD患者表现出进行性脑胰岛素抵抗和胰岛素缺乏。

接下来，我们使用公共基因集(GO、KEGG和PANTHER)对海马中差异表达基因进行富集分析，并确定了与凋亡、血清素和多巴胺、GABAnergic、谷氨酸和去甲肾上腺素途径相关基因的变化。如图所示，SPF小鼠中包括Tnf、Apaf1、Fasl等在内的促凋亡基因增加，抗凋亡基因Bcl2l1降低，尽管SPF小鼠的Bax、Bad、Casp3等促凋亡基因也减少，表明SPF和GF小鼠之间不同途径介导的细胞死亡效应因子发生改变，