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糖类抗原72-4(CA72-4)检测的鼻祖级抗体

文章来源:健康界发布日期:2023-03-22浏览次数:141

糖类抗原72-4(Carbohydrate antigen 72-4,CA72-4)又称肿瘤相关糖蛋白(TAG)-72,是一种与肿瘤相关的多形性上皮粘蛋白,分子量在220~400kDa之间。在胃癌、结肠癌、乳腺癌和肺癌等人类腺癌中高表达,而在正常组织中表达量很低。PubMed数据库中,文献报道多的TAG-72单克隆抗体(mAb)就是B72.3和第二代B72.3 mAb—CC49 mAb,B72.3和CC49 mAb所识别的表位分别是TAG-72上唾液酸Tn(Sialyl Tn,sTn,CD175s)和唾液酸T(Sialyl T,sT,CD176s)。B72.3 mAb是利用人类转移性乳腺肿瘤细胞的提取物作为免疫原通过小鼠杂交瘤技术获得的单抗,CC49是第二代B72.3 mAb,免疫原采用的是LS-174T人结肠癌异种移植物纯化获得的TAG-72。CC49对TAG-72抗原的亲和力优于B72.3。CC49和B72.3 mAb识别TAG-72的表位不同,可以形成双抗夹心用于癌症患者血清CA72-4检测。

0B72.3抗体的发现

B72.3 mAb是1981年Colcher D等在筛选与乳腺肿瘤细胞系反应的单克隆抗体时发现的。B72.3 mAb是采用人肝脏转移性乳腺肿瘤细胞膜富集提取物作为免疫原,通过小鼠杂交瘤技术获得的IgG1型单克隆抗体。Colcher D等用2名肝脏转移性乳腺肿瘤患者的肝脏制备细胞膜富集提取物(称为Met1和Met2),以正常肝脏作为对照。为去除干扰固相放射免疫分析(RIA)的细胞相关免疫球蛋白,部分细胞提取物过葡萄球菌蛋白A-Sepharose(Pharmacia)柱。

4周龄的C57BL/ 6、BALB/c和C3HfC57BL小鼠通过腹腔接种100μg转移性乳腺肿瘤细胞膜富集提取物与等体积的完全弗氏佐剂混合。14天和28天后,小鼠腹腔内接种100μg的免疫原和不完全弗氏佐剂。另外14天后,静脉注射10μg免疫原。3-4天后取脾脏与NS-1非免疫球蛋白分泌小鼠骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤进行培养。通过固相放射免疫分析对杂交瘤分泌的免疫球蛋白进行检测,选取与受累肝脏转移性乳腺肿瘤细胞提取物有反应,与正常人肝脏提取物不反应的细胞株。经传代培养,从4250份杂交瘤培养物中筛选出11株单克隆抗体。

B72.3 单抗反应性

固相放射免疫分析及活细胞RIA检测显示,仅1株IgG1型mAb—B72.3与转移性乳腺癌细胞膜富集提取物有反应,与正常肝脏细胞提取物、肉瘤和正常组织细胞系表面抗原均不反应。Colcher D等实验使用的人乳腺癌细胞系为T-20、MCF-7和ZR-75-1,肉瘤细胞系为横纹肌肉瘤(A204)、纤维肉瘤(HT1080)和黑色素瘤(A375)。正常组织细胞系来源于乳房(Hs0584Bst)、皮肤(Detroit 550)、胚胎皮肤(Detroit 551)、胎儿肺(WI -38和MRC-5)、胎儿睾丸(HsO181Tes)、胎儿胸腺(Hs0208)、胎儿骨髓(Hs074Bm)、胚胎肾脏(Flow 4000)、胎儿脾脏(Hs0203Sp)和子宫(Hs0769Ut)。

B72.3 mAb已证明对大多数人类腺癌活检有反应性,包括结直肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌和非小细胞肺癌,对正常成人组织包括(绝经后妇女)增殖性和静息性子宫内膜无反应或反应微弱。而研究显示,B72.3反应抗原在分泌期子宫内膜中表达,在某些人类胎儿组织(包括胎儿肠)中高表达。

0CC49抗体的发现

CC49是与肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)抗原反应的第二代B72.3单克隆抗体。B72.3单抗识别的抗原为TAG-72,由于缺乏可复制的TAG-72抗原来源及合适的细胞系进行表达,TAG-72抗原的表达和纯化一度受到阻碍。后来发现,分化良好的LS-174T细胞系是少数可与B72.3单抗弱结合的细胞系,当LS-174T细胞作为异种移植在无胸腺小鼠中生长时,B72.3单抗结合增加了大约100倍,与许多人类癌症活检的结合相当。Muraro R等人利用LS-174T细胞系产生的人结肠癌(CC)异种移植物提取TAG-72抗原,经过几种色谱程序纯化后(包括B72.3 mAb亲和纯化),以TAG-72作为免疫原,通过小鼠杂交瘤技术获得了IgG1型抗体—CC49单抗。

TAG-72抗原的制备纯化

将大约3g冷冻的LS-174L结肠癌异种移植物在20mM Tris-HCl(pH7.2)+150mM NaCl(TBS)中混匀后,用玻璃棉过滤。使用预先在TBS中平衡的Sepharose CL-4B柱-施胶柱进行亲和纯化(5.5x25cm,Pharmacia,Uppsala,Sweden),用TBS洗脱,收集馏分。在固相RIA中进行测试,收集TAG-72峰值组分,加载到TBS平衡的B72.3亲和色谱柱[100ml Reactor-Gel MW65F(Pierce,Rockford,IL)与200mg B72.3 IgG耦合]。用TBS洗涤,结合蛋白用3.0M Nal在TBS中洗脱。洗脱液在固相RIA中进行测试,收集TAG-72组分,在20mM Tris-HCI(pH 7.2)中进行透析,使用Aquacide II(Calbiochem,San Diego,CA)进行浓缩,在TBS中进行透析,纯化的TAG-72保存在-70℃。

TAG-72免疫

10μg上述纯化的TAG-72与等体积的完全弗氏佐剂预混合后,对3只4周龄BALB/c小鼠进行接种免疫。80天后,小鼠接受50μg纯化的TAG-72增强剂(预混合等量的不完全弗氏佐剂)。7天后,小鼠静脉注射纯化的TAG-72盐水。3天后取脾细胞,与NS-1小鼠骨髓瘤细胞(ATCC No. TIB-18)进行融合,制备杂交瘤细胞。利用固相RIA筛选与乳腺癌、结肠癌活检提取液反应,与正常肝脏、脾脏活检富膜提取物不反应的杂交瘤细胞。

CC49单抗反应性

固相RIA活检反应结果显示,CC49单抗对LS-174T结肠细胞系提取物和乳腺癌提取物的反应一样强烈。免疫组织化学分析试验显示,CC49 mAb与B72.3 mAb相同,与正常成人分泌性子宫内膜组织反应,与绝经后妇女的增殖子宫内膜和静息子宫内膜组织不反应。活细胞结合试验显示,CC49 mAb与培养的LS-174T活细胞表面抗原反应比B72.3强烈。

0CC49、B72.3单抗用于CA72-4检测

以“CA72-4”和“Carbohydrate antigen 72-4”为关键词在PubMed数据库进行检索,检索到早的文章是1988年Ohuchi N等发表的关于CA72-4 RIA检测试剂盒的文章。Ohuchi N等利用可以识别TAG-72的CC49和B72.3单抗制成CA72-4 RIA试剂盒,用于测量癌症患者循环肿瘤相关糖蛋白(TAG-72)的水平。Ohuchi N的团队通过468个健康个体CA72-4的水平和分布得到临界值4.0U/mL。82例胃癌、55例结直肠癌、24例胰胆总管癌、36例乳腺癌、3例卵巢癌的阳性率分别为52%、55%、46%、39%、67%。来自205名癌症患者的血清中有50%的CA72-4水平升高,而92名没有恶性肿瘤患者的血清中只有10%的水平超过4.0U/mL。恶性肿瘤患者血清CA72-4平均水平为38.6U/mL,远高于非恶性肿瘤患者(2.7U/mL)。胃肠道癌症晚期或复发患者血清CA72-4水平高于早期癌症患者。Ohuchi N等证实了CA72-4可作为临床新型肿瘤标志物,用于监测胃肠道癌、乳腺癌、卵巢癌和其他上皮恶性肿瘤患者的血清TAG-72水平。