间隙连接在妇产科领域的研究进展

   摘要 细胞间隙连接（gap junction,GJ）是相邻细胞间进行物质和信息交换的跨膜蛋白通道结构，对细胞增殖分化调控和内环境稳定起重要作用。间隙连接蛋白（connexin,Cx）的表达直接影响子宫平滑肌瘤发生、分娩及卵泡发育等过程。间隙连接蛋白转录抑制、功能缺陷与包括宫颈癌在内的多种肿瘤的发生、发展及转移密切相关，其蛋白表达及功能的恢复使肿瘤的恶性表型逆转。cx基因可能是新近发现的一类非突变型抑癌基因。

　　关键词 间隙连接 抑癌基因 子宫肿瘤 妊娠 旁观者效应

　　细胞间存在着间隙连接、桥粒和紧密连接等连接方式。其中，细胞通过间隙连接所介导的细胞间隙连接通讯（gap junction intercellular communication,GJIC）[1],进行着信息和能量物质的交换，对细胞的新陈代谢、增殖和分化等生理过程起重要调控作用。同时，GJIC功能异常与多种肿瘤的发生、发展及转移密切相关，间隙连接已成为当今生命科学领域中的研究新热点。

     间隙连接的结构

　　间隙连接是由相邻胞膜上的连接子（connexon）相互衔接而成。每个连接子包含六个相同哑铃形蛋白质亚单位——间隙连接蛋白（connexin,Cx）[2]，连接子即Cx的六聚体所形成的跨膜蛋白通道，见图1。连接子在质膜上常成簇出现，形成间隙连接斑（gap junction plaques），其数量直接影响GJIC功能。

图1 间隙连接结构示意图

图示相对应的细胞膜上形成内间隙连接功能

单位（连接子connexon）

　　编码Cx的cDNA具有很高的同源性，cx基因属于连接蛋白的多基因家庭（a multigene family of connexins）。根据cDNA推导编码蛋白的分子量，现已命名该家族14个成员，在各组织中的表达既有特异性，又有交叉性。

　　Cx有四个疏水性跨膜结构域[3]，分子链在胞膜上呈“M”形N末端和C末端定位于胞质内，从而形成胸质内的三个结构域和胞外的二个结构域，见图2。Cx蛋白家族成员的同源性主要取决于胞外的二个结构域，其次是跨膜结构，胞质内的差异大。保证成员之间相互作用的同时，又有组织差异性和细胞内调节的多样性。

 

图2 连接蛋白拓朴学结构示意图

图示在细胞膜上形成的双跨膜分子链

间隙连接的功能及其调节

　　相邻细胞间通过GJIC进行信息和能量物质的传递，参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联。连接蛋白通道开放时，允许直径＜1.5 nm或分子量＜1 kD的物质通过[4]，包括无机盐（Na+、K+、Ca2+等）[5]，第二信使cAMP,cGMP,1.4.5-三磷酸肌醇（IP3）等。

　　间隙连接通道的通透并非无选择性，受到多种因素影响。细胞周围pH降低，胞内Ca2+浓度的升高可抑制GJIC功能。胞内第二信使cAMP水平升高明显增强GJIC能力，蛋白激酶通过改变蛋白通道的空间构象而快速调节通道的启闭，Cx蛋白在翻译后的加工、修饰——磷酸化作用[6]，直接调节GJIC功能。癌基因ras、myc、neu等的表达可抑制GJIC，抑癌基因p53则有助于GJIC恢复。Ca2+依赖性粘附分子钙粘附素（E-cadherin），某些生长因子（EGF，TGF），雌激素、孕激素，化学促癌剂的（TPA，DDT），细胞外电压变化等对GJIC均有影响。

　　对GJIC功能的检测采用特殊的荧光染料标记传输法，即用分子量＜1 kD的Lucifer Yellow（LY）荧光染料，通过划痕标记或显微注射，将LY注入单个细胞，在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察LY至周围细胞的传输能力，从而判断GJIC的功能。

间隙连接与子宫平滑肌瘤

　　自肌肉组织中发现cx基因以后，在几乎全身所有组织中已鉴定出该家族14个成员。应用Northern blot、原位杂交、Western blot发现，非妊娠期育龄妇女子宫平滑肌组织中普遍存在着Cx43的表达。值得注意的，是子宫平滑肌瘤中cx43 mRNA和蛋白含量明显高于自身子宫平滑肌中的水平[7]，且伴随17β-雌二醇（E2）的升高。这一发现在永生化小鼠的子宫平滑肌瘤样细胞系SMU1-10中得到证实，有人认为Cx43是平滑肌相关性标志物[8]。

　　Cx43在子宫平滑肌和子宫平滑肌瘤表达的差异，体现出对甾体激素不同的反应性。原代培养自体子宫平滑肌和平滑肌瘤细胞，Cx43间隙连接通道在17β-E2作用后会自发形成，用安宫黄体酮处理后，平滑肌瘤细胞cx43 mRNA及其蛋白含量降低50%，LY传输功能下降[9]。Cx在子宫平滑肌瘤的深入研究，有助于了解平滑肌瘤发生的分子机制，建立Cx介导的治疗策略。

间隙连接与分娩

　　妊娠期子宫肌层中Cx43保持较低水平，足月分娩前和早产时，cx43 mRNA和蛋白急剧增加，间隙连接斑随之大量出现，这一过程受到甾体激素的调节。妊娠子宫含有E2、孕酮（P），E2上调cx43 mRNA和蛋白的表达，诱发宫缩，引起分娩和早产。P则抑制cx43基因的转录而发挥相反作用，终结果要依赖E2/P的比率[10]。黄体酮拮抗剂作用于临产前子宫以增加对催产素的敏感性，子宫肌层cx43 mRNA和蛋白显著增加，催产素受体浓度无明显变化，提示黄体酮对催产素的作用可能抑制Cx的功能。RU486引产的机制与阻断hCG和P对cx43基因的下调作用有关[11]。

　　Cx43在宫缩过程中的分子机制与蛋白激酶C（PKC）活性有关[12]。PKC可诱导平滑肌细胞cx43基因的转录，cx43基因启动区含有AP-1（activating protein-1）位点，与fos/jun基因同源序列结合，分娩期PKC上调子宫肌层fos/jun，促进cx43转录和表达。

　　Cx26在分娩过程Cx43升高前瞬时高表达，Cx43升高后开始下降，产前降至低点，受P的抑制[13]。Cx45在非妊娠子宫肌层出现，可保持到孕期，产前下降，产后恢复至非妊娠期的两倍。推断Cx26在分娩过程中先形成的小的间隙连接斑，为形成较大的Cx43间隙连接斑起模板作用，通过对小斑块的补充，更易于Cx43间隙连接斑的形成。Cx43、Cx26、Cx45在同一组织、相同的环境出现不同的表达效果，提示cx基因表达调控可能存在不同的转录元件。

　　多种Cx的协同表达，提供分娩时细胞间代谢物质、能量和信号转导通道，促进平滑肌细胞有效地同步收缩，为分娩提供理想的环境和条件。子宫平滑肌细胞间隙连接的形成可能是足月分娩、早产的普遍过程和必要前提，希望对间隙连接的研究能成为治疗早产的新手段。

间隙连接与卵巢

　　多种cx基因及其蛋白产物定位于卵巢，其各自分布有所不同，颗粒细胞和卵丘细胞中有Cx43、Cx37、Cx30.3，内膜中有Cx26、Cx32[14]，Cx60存在于卵泡内膜和卵丘细胞，并受到促性腺激素的调节[15]。

　　卵细胞和颗粒细胞间的间隙连接通道包含Cx37，cx37基因和蛋白缺陷的小鼠缺乏成熟卵泡，不能排卵，并生成不成熟黄体，可能是不孕的重要分子机制[16]。

　　哺乳动物卵细胞在胎儿和新生儿期，停在减数分裂的第Ⅰ期，直到LH出现减数分裂便开始，在FSH参与下，青春期卵丘—卵复合物从卵泡壁上脱落形成排卵。

　　卵细胞和体细胞间通过间隙连接通道，允许代谢物质从颗粒细胞进入卵细胞，供生长发育需要。同时，间隙连接通道实现的细胞间信号转导是保证卵泡发育及卵子形成的高度协调性的主要调节机制，并影响卵巢激素的分泌功能。

间隙连接与肿瘤

　　结构功能完整的细胞间隙连接对维持正常细胞生长、分化起重要作用。新近研究发现，多种肿瘤和转化细胞的发生与GJIC功能缺陷密切相关，cx基因的表达对绝大多数肿瘤细胞的生长起负调控作用，GJIC功能的恢复表现出肿瘤生长控制和转化表型抑制。所以，cx基因被认为是非突变型抑癌基因，证据如下。

　　一、细胞恶性转化普遍存在Cx表达缺失和GJIC功能缺陷。

　　肝细胞肝癌与正常肝相比，Cx26、Cx32、Cx43基因表达显著下降，乳腺癌中Cx26明显降低，肺癌细胞Cx43无表达，宫颈癌细胞系HeLa cx26、Cx43表达缺失。GJIC功能的缺陷，使恶性转化细胞逃离生长控制，在转移过程中逃避免疫监视，转移能力的强弱与GJIC呈负相关。

　　二、多种肿瘤促进剂通过抑制Cx表达诱发癌变。

　　肿瘤抑制剂治疗使Cx表达及GJIC有不同程度的恢复。DDT、TPA等诱导肝细胞肝癌，可非特异性抑制基因的转录或磷酸化作用。肿瘤抑制剂ATP、TFP、维甲酸处理HeLa等癌细胞，GJIC恢复，肿瘤生长抑制。

　　三、cx基因转染抑制恶性肿瘤的生物学行为。

　　将cx26转染入HeLa细胞[17]，细胞生长缓慢，裸鼠致瘤力显著下降，GJIC恢复，出现较强的逆转作用。比较cx43基因转染前HeLa细胞，前者CA重复序列突变率较转染后高20%，化学诱发HPRT基因突变率高30%[18]。cx43转染HeLa对自发的和化学诱发的基因突变抵抗力增强。

　　肿瘤基因治疗重要机理之一，是通过GJIC实现旁观者效应（bystander effect）。将单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）转染HeLa，与未转染的共同培养，加丙氧鸟苷（ganciclovir）只杀死转染细胞。转入cx43基因后重复以上实验，转染与未转染HSV-tk的HeLa细胞共同培养后都被杀灭[19]。

　　HeLa转染cx26、HSV-tk基因，出现cx26-tk、cx26-tk+、cx26+tk-、cx26+tk+四种细胞，中性红毒性实验发现，只有cx26+tk-和cx26+tk+共同培养，加入ganciclovir出现明显旁观者杀伤效应[20]。大量体内和体外实验证实，cx基因的表达及正常的GJIC功能是旁观者效应的重要基础。

　　细胞间隙连接在生理、病理过程中的重要作用，已引起研究者的广泛关注。希望通过对间隙连接的深入研究，为解决妇产科领域的诸多课题提供新的途径。

参考文献

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