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信号传导与激活因子2基因在食管癌中的表达

文章来源:发布日期:2008-06-03浏览次数:70767

作者:高广, 乌慧玲, 闻燕, 王文兵

作者单位:江苏大学生命科学研究院,江苏 镇江212013; 江苏科技大学生命科学系, 江苏 镇江212013; 上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室,上海 200032

【摘要】  目的: 筛选食管癌中特异表达的基因,进一步了解食管癌发生的分子机制。方法: 利用荧光差异显示技术(DD-PCR)获得差异表达的片段,对这些片段进行克隆和序列分析。通过在基因库中同源性检索,查找差异片段相对应的同源基因。利用实时荧光定量PCR技术在食管癌临床标本中进行验证。结果: 通过DD-PCR获得的差异片段中有一个片段对应于信号传导与激活因子2(stat2)基因,该基因的读码框长2 556 bp,编码852个氨基酸,编码蛋白分子量约97.9 kD。应用实时荧光定量PCR方法进一步验证发现该基因在食管癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织(P<0.05, n=16)。结论: stat2基因在食管癌组织中呈高表达,推测其可能在食管癌的发生发展中起一定的作用。

【关键词】  荧光差异显示; 定量PCR; 食管癌; 信号传导与激活因子2; 基因表达

[基金项目] 上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室开放基金(80-07-02);  江苏大学第六批科研立项项目(06A006)
    Signal transducer and activator of transc[x]ription 2 gene highly expressed in esophageal

  GAO Guang,  WU Hui-ling,  WEN Yan,  WANG Wen-bing

  (Institute of Life Sciences,Jiangsu University, Zhenjiang  Jiangsu 212013;  School of Life Sciences,Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang  Jiangsu 212013;  National Laboratory for Oncogenes and Related Genes, Shanghai Cancer Institute, Shanghai  200032, China)

  [Abstract]  ob[x]jective: To further investigate the molecular mechanism of esophageal carcinogenesis, and to validate the genes expressed differently in esophageal cancer. Methods: mRNA differential display(DD-PCR) was employed to search differently expressed fragments, some of which were cloned and sequenced. By homology analysis in GenBank, corresponding homologous genes of those fragments were found. The corresponding genes of those differently expressed fragments were validated by Real-time quantitative PCR. Results: By DD-PCR, one of the highly expressed EST in cancer tissues was identified to be Homo sapiens signal transducer and activator of transc[x]ription 2(stat2)gene. The results of real-time quantitative PCR showed that the ex[x]pression level of stat2 in esophageal cancer tissues were significantly higher than that in normal tissues(n=16, P<0.01). The ORF of stat2 gene was 2556 ba[x]se pair long and encodes 852 amino acids. The molecular weight was about 97.9 kD. Conclusion: The over-ex[x]pression of stat2 gene may indicate an important role in the occurrence and development of esophageal cancer.

  [Key words]   fluorescent differential display;  real-time quantitative PCR;  esophageal cancer;  stat2;  gene ex[x]pression

  食管癌是主要的恶性肿瘤类型之一,我国是世界上食管癌的高发地区。同时,食管癌的发生在我国也具有地区差异性,如河南省林县和江苏省扬中地区等都是食管癌高发地区。目前,已发现一些食管癌的癌变机制相关因素,但关键原因尚未明确[1]。癌基因、抑癌基因和细胞周期控制基因的异常表达参与了食管癌及其他恶性肿瘤的演进[2],如Ohta等[3]的研究表明肿瘤抑制基因-FHIT基因,在大约50%的食管癌、胃癌和结肠癌中存在转录异常,Gleeson等[4]在Barrett食管腺癌中发现了特异性p53突变谱。而细胞周期控制基因cyclinD1的扩增与食管鳞癌明显相关[5]。在癌基因中stat(singnal transducers and transc[x]ription activator,  stat)家族和myc家族等均对肿瘤的发生起重要作用。STAT家族是具有高度同源性的转录因子,可介导多种细胞因子和生长因子的信号向细胞核内转导,影响靶基因的转录,从而调节细胞功能,与肿瘤发生、发展和凋亡有密切关系[6]。目前有关stat2在各种肿瘤中表达状况的报道很少,本研究应用mRNA定量分析的方法发现stat2基因在食管癌中呈现高表达,为食管癌发生的机制研究提供了新思路。

  1  材料与方法

  1.1  临床材料
 
  标本来自2006年6月至11月于江苏大学附属医院接受手术治疗的16例食管癌患者。每例患者均取手术切除的食管癌组织及癌旁正常组织,并经病理检查证实。组织离体后立即在液氮中速冻,并置于-70 ℃冰箱中保存。

  1.2  试剂和仪器
 
  RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司,荧光差异显示试剂盒购于Genhunter公司,Supersc[x]riptⅡ反转录试剂盒购于Gibco公司,荧光定量PCR试剂盒和PMD18T-vector试剂盒购于TaKaRa公司。主要仪器有FMBIOⅡ(HITACHI)荧光差异显示系统,STRATAGENE MX3000P荧光定量PCR仪,GenspecⅢ(HITACHI)。

  1.3  总RNA的制备
 
  每例取约20 mg 标本放入1 ml Trizol中,充分研磨,移入离心管,加入200 μl 氯仿,混匀,4℃ 12 000 r/min 离心20 min,将上清移至含有300 μl异丙醇的离心管中,混匀,室温沉淀20 min,4℃ 12 000 r/min 离心15 min,弃上清,用不含RNase的70%乙醇清洗后烘干,加入30 μl 不含RNase的双蒸水溶解。用不含RNase的DNaseⅠ去除污染的基因组DNA。用GenspecⅢ检测RNA,确定其质量和浓度。同时取0.5 μl 进行琼脂糖凝胶电泳,检测RNA完整性。

  1.4  荧光差异显示(FDD)
 
  反转录反应分别用锚定引物HT11A,HT11G,HT11C。以总RNA为模板进行反转录反应,每管反应体系如下:取总RNA(1 μg/μl)2 μl,加入锚定引物(2  μmol/L) 2 μl,混匀,65℃加热5 min,迅速置于冰上,加入5×Supersc[x]riptⅡRT缓冲液 4  μl,RNase抑制剂(40 U/μl)0.5 μl,DTT(100 mmol/L)2 μl, dNTP(250 μmol/l) 2 μl, Supersc[x]riptⅡ逆转录酶(200 U/μl)0.2 μl,加入DEPC水将总反应体系补至20 μl。反应条件:25℃ 5  min,42℃ 10 min,50℃ 60 min,72℃ 15 min。
 
  荧光差异显示PCR选用与反转录反应所用锚定引物序列完全相同的荧光标记锚定引物(FHT11A,FHT11G,FHT11C),选用试剂盒中的随机引物HAP-9。反应体系:反转录产物2 μl,10×缓冲液 2 μl,dNTP(250 μmol/L) 2 μl,FHT11N(n=A,G,C)2 μl,HAP-9(2 μmol/L) 2 μl,Taq酶(5 U/μl)0.2 μl,用无RNA酶的H2O将总体系补至20 μl。反应条件:94℃ 2 min;94℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃ 1 min,35 个循环;72℃ 10 min。
 
  PCR产物8 μl中加入2 μl上样缓冲液置于PCR仪上,80℃ 变性 5 min。随后,PCR产物在电泳仪上样,在6 %的聚丙烯酰胺凝胶上以1 400 V恒压电泳5 h左右。电泳结束后将凝胶在FMBIOⅡ荧光差异显示系统上扫描。从胶板上切取差异条带。
 
  1.5  差异片段的克隆
 
  差异的条带经切割和处理后作为模板,进行再次扩增, 反应条件和反应体系同次PCR扩增。将差异片段与PMD18T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。用蓝白斑筛选阳性克隆,阳性克隆经酶切鉴定后测序。

  1.6  荧光定量PCR分析
 
  应用Primer5.0软件设计用于定量PCR的stat2基因引物,选用β-actin作为内参,检测stat2基因在16例食管癌组织与癌旁组织中的表达,引物序列见表1。 反应体系参照TaKaRa公司荧光定量PCR试剂盒的说明书。反应条件:94 ℃ 20 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35 个循环。根据2-ΔΔCt公式计算stat2基因相对拷贝数。

  1.7  统计学处理
 
  应用SPSS14.0统计软件, 采用单因素方差分析,以P<0.05 为有统计学意义。

  2  结果

  2.1  食管癌和癌旁组织总RNA的提取
 
  提取的总RNA进行凝胶电泳结果显示, 28 S和18 S条带较为明显,总RNA 的完整性和质量较好。为进一步证实,采用GeneSpecⅢ检测,D(260 nm)/D(280 nm)值均在1.8~2.0之间,结果与电泳结果一致,达到反转录要求。

  表1  stat2基因荧光定量PCR验证及全长基因克隆的引物序列(略)

  Tab 1  Primer sequences used for quantitative RT-PCR and stat2 full length cloning

  2.2  荧光差异显示结果及阳性差异片段的筛选
 
  聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现,食管癌组织和癌旁组织中基因的表达存在差异性。为进一步了解这些差异片段的信息,将差异片段切出后,进行二次扩增,并对扩增到的片段进行克隆和序列分析。将测序获得的序列在NCBI数据库中进行比对,其中一个差异片段(图1)与基因库中的stat2基因同源性达到。
 
  图1  荧光差异显示凝胶图谱(略)

  Fig 1  Example of differential display fingerprints

  2.3  荧光定量PCR结果
 
  对荧光定量PCR结果进行分析,发现stat2基因在食管癌癌组织中的表达量高于癌旁组织, 癌组织中stat2基因表达量大约是癌旁组织中的3.7倍,其差异具统计学意义(P<0.05)(图2)。
 
  图2  stat2基因在16例食管癌组织及癌旁组织中平均相对表达量(略)

  Fig 2  Relative quantification of stat2 mRNA level in esophageal cancer tissues and  normal tissues

  2.4  stat2基因全长ORF的克隆
    
  根据获得的基因的序列,设计特异引物用于stat2基因全长ORF的克隆,引物序列见表1,将扩增出来的stat2基因与PMD-18T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,以SalⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定阳性克隆(图3),将阳性克隆进行测序分析。
   
  M: DNA Marker/λ-Hind Ⅲ digest;  1: stat2 PCR产物; 2: PMD-18T+stat2双酶切; 3: 阳性质粒为模板PCR产物

  图3  stat2基因ORF克隆的电泳图谱(略)

  Fig 3  Full length cDNA of stat2 gene
 
  3  讨论

 
  STAT为一种核转录因子,哺乳动物中STAT家族成员参与了多种细胞因子、生长因子的信号转导,调节人体免疫反应、炎症反应和细胞的生长、分化等。STAT具有强烈的抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用,参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演进[7],STATs蛋白家族成员的相对分子质量在84~113 kD之间,有共同的5个保守结构域,其中第600到第700位氨基酸残基为高度保守的SH2 区,是STATs对活化的受体复合物补位、JAK激酶家族磷酸化STATs、STATs二聚体化及结合DNA所必需的。目前,对STATs家族在肿瘤发生、发展中作用的研究主要集中在STAT1, STAT3,STAT5。STAT1是个发现的STAT成员,可被INFα,INFγ,IL26等细胞因子激活,STAT1介导细胞凋亡过程的信号转导,并能负性调节c-myc启动子表达,在多发性骨髓瘤、乳腺癌等肿瘤中, 可检测到STAT1的高表达[8]。已证实STAT3的异常活化与中枢神经系统疾病、肿瘤、白血病、心血管疾病、肥胖、肝细胞再生等多种病理生理过程有着密切的关系[9,10]。STAT5由两种高度同源的STAT5a和STAT5b组成,在多种造血系统肿瘤中,STAT5被活化[11]。
 
  目前国内外关于stat2在各种肿瘤中表达情况的报道很少,一般认为STAT2与STAT1形成二聚体而参与JAK/STAT信号通路[12]。本研究利用荧光差异显示技术及荧光定量PCR等方法,发现stat2基因在食管癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织,推测stat2基因在食管癌组织中的高表达可能与食管癌的形成相关。其可能的机制是,癌组织中高表达量的STAT2通过其SH2结构域与受体上的磷酸化Tyr残基结合,并在JAK激酶的作用下,其C端Tyr残基发生磷酸化,磷酸化的STAT2与磷酸化的STAT1也通过SH2结构域相互作用形成二聚体并进入细胞核,与相关基因的启动子区域结合,再经过某种修饰作用(如Ser 的磷酸化) 诱导基因表达,进而参与肿瘤的发生和演进。对stat2基因的功能以及stat2基因在其他恶性肿瘤中是否高表达等方面进行深入研究,将有助于解析食管癌形成、发展的机理。

【参考文献】
    [1] 闻 燕,王文兵,高 广,等.食管癌中高表达的钙结合蛋白1基因的序列分析及意义[J].江苏大学学报:医学版,2007,17(2):155-157.

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