PCR检测儿童微小残留白血病的研究进展

作者：何映谊　叶铁真　　作者单位：广州医学院附属医院儿科，广州 510120

　　【摘要】微小残留白血病(MRD)是指白血病经化疗缓解后在骨髓中仍存在形态上不能检测到的白血病细胞，是白血病复发的主要原因。儿童MRD的检测对判断儿童白血病的预后、制定白血病的治疗方案有重要意义。PCR方法在MRD检测中具有快速、特异、简便、经济和样本量少等特点。本文综述近年以多重PCR初筛白血病靶基因，以荧光定量PCR(FQPCR)追踪MRD方面所取得的进展。

　　【关键词】 微小残留白血病 PCR 多重PCR FQPCR 儿童白血病

　　Abstract MRD detection in children leukemia has a potential importance to predict clinical outcome and to modify treatment protocols of the diseases. Although some patients with leukemia have achieved complete remission according to the clinical and morphological criteria, there are still very low numbers of malignant cells that can not be discriminated by morphology and remained in bone marrow, which is called minimal residual disease (MRD) and is the main reason leading to relapse. MRD detection has an important significance for designing treatment protocols. Several methods of MRD detection have been developed. These include conventional cytogenetics, fluorescence in situ hybridization (FISH), flowcytometric immunophenotyping (FCM), Southern blot and polymerase chain reaction (PCR) techniques, etc. Each of these techniques has its advantages and disadvantages, so not all of them are suitable for clinical MRD detection because of several inherent disadvantages, such as limited sensitivity, timeconsuming, high cost, or requiring highquality DNA or RNA. For example, the sensitivities of conventional cytogenetics, FISH, FCM and Southern blot approaches for MRD monitoring are 10-1-10-2, 10-2,10-3-10-4 and 10-1, respectively. Relatively, PCR can reach a good sensitivity of 10-4-10-6, and show more advantages, such as fast, specific, simple and lowcost, as well as minimal amounts of DNA or RNA for detection, etc., so PCR has its specific features for MRD detection. In this review, the progress on the detection technique for screening leukemia specific marker by muitiplex PCR and FQPCR in recent years are summarized.

　　Key words minimal residual disease; PCR; multiplex PCR; FQPCR; children leukemia

　　微小残留白血病(minimal residual disease， MRD)是指白血病经化疗取得完全缓解后，骨髓中仍存在形态上不能检测到的白血病细胞，是引起白血病复发的主要原因。准确测定MRD对临床制定治疗方案具有重要意义。目前用于检测MRD的方法有核型分析、荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)、流式细胞术(flowcytometric immunophenotyping, FCM)、Southern blot和PCR等，不同方法各有利弊。核型分析、FISH、FCM和Southern blot等的敏感性分别为10-1-10-2、10-2、10-3-10-4和10-1，难以满足对MRD诊断的需要，且都存在或操作费时，或费用较高，或对样本要求较高等不足之处。相对而言，PCR检测MRD的敏感性可达10-4-10-6，且具有快速、特异、简便、经济、样本量少等优点，因此用于MRD检测独具优势。本文综述PCR在儿童急性白血病MRD检测中的应用研究进展。

　　初诊白血病靶分子的初筛——多重PCR

　　在白血病初诊时筛选肿瘤标志，可作为MRD追踪的靶目标。而肿瘤标志的筛选需考虑样本用量、费用、效率等问题。多重PCR(multiplex PCR)是在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域，可一次性筛选出目的DNA，具有检测的覆盖面较广、效率较高、费用相对较低等优点，目前国际上通常采用此法作为白血病肿瘤标志的初筛。

　　多重PCR初筛融合基因的临床意义 目前已经发现的、与白血病相关的融合基因有50多种，由于其在白血病的发展过程中比较稳定，因此可作为白血病初筛及MRD追踪的标志。融合基因在各种白血病中的发生率： 在急性前B淋巴细胞白血病(preBcell acute lymphoblastic leukemia, preB ALL )中为40%-50%，在T淋巴细胞白血病(Tcell acute lymphoblastic leukemia, TALL)中为10%-25%，在急性髓系细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)中约为30% [1]。

　　Pallisgaard等建立一种逆转录多重巢式PCR(multiplex RTPCR )方法。他们设立了8个PCR管，进行逆转录多重巢式PCR，用于筛选急性白血病中29种染色体易位(超过80种融合基因)。样本包括102例AML、62例儿童ALL患者的冻存或新鲜骨髓和外周血。结果显示： 44% AML，45% ALL患者融合基因阳性，而在融合基因阳性的标本中33% AML及47% ALL用常规的细胞遗传学方法不能检测出来。

　　Olesen等[2]用逆转录多重巢式PCR和传统细胞遗传学方法同时检测了AML、ALL等共328例病人的骨髓和外周血标本。结果显示：融合基因检测阳性率为25%，细胞遗传学检测阳性率为15%;在88例儿童标本中，两种方法检测均阳性的占28%，但其中16%核型分析并没有发现染色体易位，而是检测出另一些染色体畸变。

　　由欧洲8国14个实验室共同参与研究制定的"急性白血病MRD分析：国际标准和临床评价行动"(BIOMED1行动)，针对与预后相关性较大的9种染色体畸变，建立了一套标准化的多重PCR方法检测MRD [4]，使MRD的检测具有统一的标准和质量控制。

　　多重PCR 初筛融合基因应注意的问题 综合目前的文献，在设计多重PCR检测融合基因时需考虑下列问题： ①在RNA水平上检测融合基因：由于大部分断裂点融合区长度超过10 kB，常规PCR较难扩增如此长的序列，而且大部分断裂点跨过一个或几个内含子，使得在DNA水平上确定这些融合基因变得繁琐和耗时。但如果以融合mRNA为模板逆转录出cDNA，就可以解决上述问题。②逆转录引物的设计：目前通常以随机引物或多聚dT引物逆转录cDNA，如设计融合基因特异的cDNA引物进行逆转录，可使特异性增强25-125倍。③增设"移位引物"(shifted primers)以减少假阳性发生：为排除假阳性结果，可在外引物的外侧再设计1对"移位引物"，当巢式PCR结果为阳性时，再以1侧"移位引物"和另1侧内引物扩增原始模板，或在第1轮PCR后，以内引物为探针进行点杂交。

　　Ig/TCR基因重排的初筛

　　多重PCR初筛Ig/TCR基因重排的临床意义 在淋巴细胞早期分化过程中，Ig和TCR的VDJ基因发生重排，使得每个淋巴细胞均有一个特异性VDJ基因组合编码的Ig或TCR分子可变区。而在VDJ基因连接部，DNA片段的随机插入或缺失又增加了连接区序列的多变性。恶性肿瘤都是单克隆来源的，即同一患者的所有肿瘤细胞连接区的序列是一致的，因此可以作为肿瘤特异性标志。

　　以Ig/TCR基因重排为靶基因的优点是其在白血病中发生率较高，见于95%以上儿童ALL和约10%AML[1]。但30%-50%儿童白血病病程中，Ig/TCR分子可形成寡克隆或发生克隆演化，因此以此作为MRD追踪的标志，易出现假阴性结果。

　　欧洲BIOMED1行动以TCRD、TCRG、IGK(Kde)等3个基因以及TAL1缺失为靶目标，设计54对引物，25管PCR反应，其对ALL检测的覆盖率超过90%。随后再根据PCR产物的测序结果设计特异性寡核苷酸(allelespecific oligonucleotide， ASO)探针或引物进行MRD追踪[5]。结果显示： TCRD、TCRG、IgK/Kde基因重排在儿童preBALL中的发生率分别为55%、60%和50%，在儿童TALL中为50%、90%和0%，同时存在两种基因重排的发生率： preBALL为70%，TALL为90%。欧洲BIOMED2行动则在BIOMED1行动的基础上，对多重PCR方法进行改良，设计107对引物，18管PCR反应，即可检测所有Ig/TCR基因重排[3]。

　　多重PCR初筛Ig/TCR基因重排应注意的问题 ①引物设计： Ig/TCR基因的V、D、J区数量多、变化大，针对每个基因设计引物进行PCR反应是不可行的。引物设计的原则是：在不同家族的V区保守序列上设计一条家族引物(family primer)作为上游引物，以J区保守序列上的共有引物(consensus primer)作为下游引物，可以减少PCR反应管数。另外，也可针对重排发生率高的V区设计引物。②结果分析： Ig/TCR基因PCR产物有多克隆(正常淋巴细胞在不同抗原刺激下经高频体细胞突变后的产物)、单克隆(来源于肿瘤细胞的一种重排)和寡克隆(来源于肿瘤细胞的两种或两种以上重排)，以琼脂糖凝胶电泳难以将三者区别开来，目前常用异源二聚体分析和基因扫描分析Ig/TCR基因PCR产物，以鉴别单克隆淋巴细胞和多克隆淋巴细胞。异源二聚体分析具有方法简单、迅速、价廉等优点，敏感性约5%，但其结果易受多克隆淋巴细胞数量的影响。基因扫描分析的敏感性可达0.5%-1%，但需要专门的检测设备。

　　MRD的追踪——荧光定量PCR

　　目前对MRD进行定量监测的方法有极量稀释法、竞争PCR、荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR, FQPCR)等，但前两者有步骤繁琐、费时、费力，且易污染、不准确、灵敏度低等缺点。而FQPCR能较好地解决上述问题。FQPCR方法结合探针和引物的合理搭配，以Ig/TCR重排、染色体易位断裂融合区为标志，可对急性白血病的MRD进行快速、精确的量化检测[4]。由欧洲10个国家26个实验室共同参与研究制定的“欧洲防癌计划——MRD的FQPCR检测”，通过以FQPCR方法对15种常见的融合基因进行检测，建立了一套标准化的MRD的FQPCR检测方法，以评价各个化疗方案的相对有效性。该标准化方法在儿童及成人ALL及AML中的检出率达30%-40%，在CML中超过95%[5]。

　　目前追踪MRD常用的靶基因及其临床意义

　　bcrabl融合基因 产生于t(9;22)(q34;q11)，在儿童ALL的发生率为3%-5%[7]，是儿童ALL预后不良的独立因素。Scheuring等[7]追踪了56例bcrabl融合基因阳性的ALL患者，经格列卫(STI571)治疗后，全部bcrabl水平均下降，但随后其中24例bcrabl水平又回升，这24例后全部复发。分析显示：复发时间与bcrabl降至低点时的水平、bcrabl回升的幅度和速度等相关。外周血bcrabl相对拷贝数的低值高于或低于5×10-4者，平均复发时间分别为27天和83天;回升幅度高于或低于2个log值者，平均复发时间分别为22天和83天，平均生存时间分别为47和312天;回升速度超过或低于1.25 log/month者，平均复发时间分别为39天和157天。骨髓bcrabl相对拷贝数的低点高于或低于1×10-4者，平均复发时间分别为26天和81天;回升速度高于或低于0.6 log/month者，平均复发时间分别为33天和157天。

　　telaml1融合基因 产生于t(12;21)(p13;q22)，在儿童ALL中的发生率为25%[9]，是预后良好的指标，应将其作为MRD监测的常规指标。Taube等[9]用FQPCR方法比较了talaml1和Ig/TCR作为靶基因的敏感性，结果发现两者敏感性一致。Pine等[10]追踪了24例telaml1阳性的儿童前BALL，其中4例复发，与初诊比较，复发时的肿瘤细胞核型、表面抗原及Ig/TCR基因重排均发生了改变，而telaml1融合基因则持续存在，且其DNA序列与初诊时相同，说明telaml1的表达较Ig/TCR稳定。

　　IgH基因重排 在BALL的发生率为95%[11]，是目前BALL患儿MRD追踪的主要标志，但在疾病发展过程中约30%-40%病例发生克隆演化，极易导致MRD检测结果呈假阴性。IgH寡克隆形成及克隆演化的发生机制为VV片段置换和VHDJH前体重排，但不累及DJ序列，因此应用特异性PCR引物扩增DJ区，可使克隆演化所致的假阴性减少。Donovan等[12]对151例儿童BALL的IgH重排进行扩增和测序。根据测序结果，在J区上的FR3区域设计7条探针，配合ASO引物，进行FQPCR，追踪了16例患儿IgH重排数量的变化。结果显示：取得持续完全缓解的10例患者，IgH重排的相对拷贝数从初诊时的5×103-5×105逐渐下降至低于检测水平(<10-4)。其余6例的IgH重排拷贝数虽然在治疗开始后有所下降，但随后逐渐升高，终全部复发。

　　IgKKde基因重排 Kde (Kappa deleting element)是位于JκCκ区下游24 kb处的1个结构，能与Vκ、JκCκ内含子中的重组信号序列(recombination signal sequence， RSS)发生重排。IgKKde重排作为FQPCR检测的靶基因有两个优点：①相对稳定，因Kde结构中参与重排的是RSS，其缺失后并不能发生再次重排，因此被称为"后阶段的重排"，另外其寡克隆发生率小于10%，且容易消失，不会在疾病过程中出现寡克隆形式的基因重排。②IgKKde重排只包含一个功能区(VκKde或RSSKde)，以序列相对有限的功能区为模板设计ASO引物相对简单。Dongen等[3]的统计显示：儿童前BALL发生IgKKde重排者约50%，其中VκKde为69%，RSSKde为31%。Velden等[13]以IgKKde重排为靶基因，利用BIOMED1相关行动提供的多重 IgK PCR方法对77例儿童前BALL进行检测，结果显示与Southern blot符合率达91%，94% IgKKde重排在初诊和复发时是一致的。对8例复发患儿进行随访，其FQPCR结果与ASO探针的点杂交结果完全一致，且敏感度大于10-4。鉴于IgKKde重排在前BALL中的高发生率、高稳定性，以及FQPCR检测的高敏感性，提示IgKKde重排可作为BALL患者MRD追踪的较好指标。

　　BFM协作组[15]以Ig/TCR重排为靶基因，追踪240例ALL患儿的MRD，共观察T1(诱导后)、T2(巩固前)和T5(化疗后1年)等9个时间点，根据MRD水平将患儿分为3组：低危(LR)组(T1、T2两个时间点MRD均为阴性)、高危(HR)组(T1、T2两个时间点MRD水平≥10-3)和中危(IR)组(低危和高危以外患者)。结果显示： 3组的3年复发率分别为2%、75%和23%;MRD在T1转为阴性者的3年复发率远低于T2转为阴性者(2% vs 23%);IR组患儿T5时MRD阴性和阳性的3年复发率分别为10%和67%，差别有显著的统计学意义。因此认为，T1和T2的MRD水平对预测复发风险有意义，T1的MRD可识别LR患儿，T2的MRD识别HR患儿，T5的MRD可预测IR患儿预后。

　　融合基因在白血病病程中表达稳定，无寡克隆和克隆演化形成的风险，初筛方法简便，但其在儿童白血病中的发生率较低;而Ig/TCR在儿童白血病中的发生率较融合基因高，但存在寡克隆和克隆演化形成的风险，必须根据每一病例设计特异性探针和引物。因此，两者在MRD检测中有互补意义。

　　FQPCR追踪MRD需注意的问题

　　探针和引物的设计 由于每例白血病均有特异的Ig/TCR重排，因此探针和引物的设计是提高FQPCR特异性的关键。目前常用两类探针： ①ASO探针，即以Ig/TCR基因中的保守序列设计共有引物进行PCR，扩增出标本中的肿瘤克隆，再对PCR产物测序，根据测序结果为每个病例设计1条ASO探针，然后配合两端的胚系引物进行FQPCR。ASO探针可排除其它淋巴细胞的干扰。②针对保守区设计的探针，即针对每个病例合成1条克隆特异性的ASO探针较昂贵，Verhagen等[14]人的研究解决了这一问题：他们选择在IgH的胚系J区设计探针和家族特异的下游引物，在多变的连接区设计ASO作为上游引物，进行FQPCR，从而实现对多变Ig/TCR的定量检测。此法较ASO探针联合胚系引物进行FQPCR更为敏感(前者为10-4-10-5，后者10-3-10-5)，原因可能是ASO引物消除了正常淋巴细胞克隆与肿瘤克隆之间的竞争。

　　靶基因的选择 作为MRD动态监测的靶基因，应具备以下条件： ①在白血病中发生率较高。②在疾病发展过程中能稳定表达。③特异性探针和引物的设计相对容易。而各种融合基因和Ig/TCR基因重排有各自的特点，因此在实际应用中需全面考虑，寻找合理的解决办法。

　　检测范围的确定 由于FQPCR检测的高度敏感性，当样本中目的基因含量太低时，需要对定量值进行可信性分析。Ballerini等[15]以表达tam/aml1融合基因的Reh细胞株RNA为标准品，摸索tam/aml1的定量检测范围: 当把1 μg RNA稀释104倍时，可以检测到tel/aml1 cDNA的平均循环阈值(cycle threshold， CT)为37.8，各PCR反应管之间CT值的变异系数(coefficient of variation, CV)为0.8%-2.4%;但将RNA进一步稀释至5×104倍和105倍时，可检测到tel/aml1 cDNA的CT值超过40，其CV超过2.5%。此情况提示此定量结果并不可靠。因此靶基因的FQPCR检测范围及其定量值的可信度，应通过对标准品倍比稀释进行FQPCR，以获得CT值的CV来确定。

　　小 结

　　PCR作为MRD检测的重要方法，将白血病分子水平的改变与临床表现及预后联系起来，对白血病的诊治具有指导意义。然而，PCR技术本身仍存在一定的局限性，如每次反应检测的靶基因种类有限、反应体系和条件的不同可导致结果的差异等，在判断其结果时，应结合临床和其它实验室资料进行综合分析。近年来发展的PCR基因芯片技术，综合了基因芯片技术高效、微型化、自动化，以及PCR技术敏感、特异的优点，将弥补单纯PCR检测MRD的不足。

　　MRD检测的目的是建立分子生物学水平的CR标准，以指导临床判断预后、制定治疗方案。为此，需要对大量病例进行长期随访。MRD检测方法学的建立和标准化，及其在全国范围的规范性使用，应与白血病的全国诊疗方案处于同等重要的地位。

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