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RANTES-403G/A、MCP-1-2518A/G基因多态性与呼

文章来源:创新医学网发布日期:2012-10-26浏览次数:33125

  【摘要】目的:探讨调节激活正常T细胞表达、分泌的细胞因子(RANTES)-403G/A、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)-2518A/G基因多态性与呼吸道合胞病毒(RSV)毛细支气管炎易感性的相关性。方法:应用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测150例RSV毛细支气管炎患儿和120例正常儿童上述位点单核苷酸多态性(SNPs)。结果:病例组RANTES-403G/A基因型和等位基因型频率分别为GG 20.7%、GA 63.3%、AA 16.0%、G 52.3%、A 47.7%,对照组为GG 37.5%、GA 46.7%、AA 15.8%、G 60.8%、A 39.2%,两组基因型频率差异有显著性(P<0.05);病例组A等位基因频率高于对照组(P<0.05),与G等位基因携带者相比,A等位基因携带者患病风险增加(OR=1.415,P<0.05)。两组MCP-1-2518基因型和等位基因频率差异无显著性(均P>0.05)。结论:RANTES-403 A等位基因与RSV毛细支气管炎易感性相关,其可能是影响发病的一个重要候选基因;未发现MCP-1-2518A/G基因多态性与RSV毛细支气管炎易感性存在关联。
  【关键词】 呼吸道合胞病毒;毛细支气管炎;基因多态性;RANTES;MCP-1

  Abstract: ob[x]jective: To explore the correlation of regulated on activation,normal T cell expressed and secreted (RANTES) and monocyte chemotactic protein 1(MCP-1) gene polymorphisms with the susceptibility of respiratory syncytial virus (RSV) bronchiolitis. Methods:?RANTES-403G/A and MCP-1-2518A/G were genotyped with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism in 150 children with RSV bronchiolitis and 120 healthy subjects. Results:The frequency of each genotype for RANTES-403G/A was 20.7%?(GG),63.3%?(GA),16.0%?(AA) in case group and 37.5%?(GG),46.7%?(GA),15.8%?(AA) in control one,respectively. There was significant difference between two groups?(P<0.05). The frequency of each allele was 52.3%(G),47.7%?(A) in case group,and 60.8%(G),39.2%?(A) in control group. The frequency of A allele was significantly increased in case group?(P<0.05);Children carrying with A allele increased risk for RSV bronchiolitis compared with those with G allele (OR=1.415, P<0.05). There were no significant differences for genotype and allele frequency of MCP-1-2518A/G between two groups?(P>0.05). Conclusion:?RANTES-403A allele is associated with the susceptibility and may be one of candidate genes for RSV bronchiolitis. No correlation is found between MCP-1-2518A/G gene polymorphisms and the susceptibility of RSV bronchiolitis.

  Key words: respiratory syncytial virus;bronchiolitis;gene polymorphisms;regulated on activation,normal T cell expressed and secreted;monocyte chemotactic protein-1

  呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿下呼吸道感染常见的病原,研究显示,RSV感染的气道上皮细胞能产生调节激活正常T细胞表达、分泌的细胞因子(RANTES)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)等趋化因子,从而引发过度的气道炎症反应[1-2]。RSV感染患儿鼻腔盥洗液及鼻咽分泌物RANTES水平明显增高,且与疾病严重程度相关[3-4],有低氧表现的RSV毛细支气管炎患儿鼻炎分泌物中MCP-1水平明显升高[5],提示趋化因子可能在RSV感染发病中发挥重要作用。几乎所有儿童2岁时均感染RSV,但仅1%~2%需住院治疗,造成病情差异的原因尚不清楚,许多严重RSV感染患儿并不存在早产、先天性心脏病、支气管肺发育不良等高危因素,因此,宿主的遗传因素与RSV感染发病的关系正成为研究的焦点。既往研究已证实调控RANTES和MCP-1的基因位点存在多态性[6-7]。本研究通过病例-对照分析,探讨RANTES-403G/A、MCP-1-2518A/G的单核苷酸多态性(SNPs)与RSV毛细支气管炎易感性的相关性,筛选与疾病易感性相关的SNP位点。
  1 对象和方法
  1.1 对象 病例组为2006年11月-2007年3月入住温州医学院附属育英儿童医院呼吸科,诊断为RSV毛细支气管炎患儿150例,其中男111例,女39例,年龄1~24个月,有早产、双胎、先天性心脏病、支气管肺发育不良、免疫缺陷等基础疾病者除外。对照组选择同期健康体检的儿童120例,男92例,女28例,年龄2~24个月。两组均无特应性疾病史及家族特应性疾病史,均为汉族,无血缘关系。
  1.2 方法

  1.2.1 基因组DNA提取:用Chelex-100快速提取法提取基因组DNA。
  1.2.2 聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测:各位点信息、引物、产物长度、PCR反应条件及限制性内切酶见表1。PCR反应体系为20μL:Primer F(10μmol/L)1μL,Primer R(10μmol/L)1μL,dNTPMix(2 mmol/L)2μL,MgCl2(25 mmol/L)1.6μL,10×Buffer 2μL,DNA模板2μL,Taq DNA聚合酶(1?U/μL) 1.5μL,去离子水8.9μL。取PCR产物5μL,限制性内切酶3 U,10×Buffer 1μL,余用去离子水补齐,总体积为10μL,37 ℃水浴箱中酶切过夜。30 g/L琼脂糖凝胶鉴定基因型(见图1、图2)。
  1.3 统计学处理方法 基因型与等位基因频率Hardy-Weinburg平衡吻合程度用x2检验;基因型及等位基因频率的比较用x2检验;用Logistic回归模型判断等位基因型对发病危险度的影响。
  2 结果

  2.1 RANTES-403G/A基因型及等位基因分布 病例组和对照组均可见GG、GA、AA 3种基因型,以GA杂合子基因型为主;经Hardy-Weinberg平衡检验,对照组的遗传平衡,表明该群体来自同一孟德尔群体(x2=0.052,P>0.05);而病例组的遗传不平衡(x2=10.894,P<0.05)。两组基因型频率差异有显著性(x2=10.024,P<0.05);病例组A等位基因的频率明显高于对照组(x2=3.912, P<0.05)(见表2);与G等位基因携带者相比,A等位基因携带者患RSV毛细支气管炎的风险明显增加 (OR=1.415,95%CI:1.003~1.996,P<0.05)。
  2.2 MCP-1-2518A/G基因型及等位基因分布 病例组和对照组均可见GG、GA、AA 3种基因型,以GA杂合子基因型为主;经Hardy-Weinberg平衡检验,对照组的遗传平衡(x2=0.468,P>0.05);而病例组的遗传不平衡(x2=8.153,P<0.05)。两组基因型和等位基因型频率差异均无显著性 (见表3)。
  3 讨论

  RANTES基因位于人染色体17q11.2-q12,该区域与哮喘等特应性疾病基因连锁,目前,RANTES基因启动子区研究多的3个多态性位点分别为-403G/A、-109T/C、-28C/G。其中-403位点G/A的变异,可能对其基因转录造成影响,从而影响疾病的发生发展。Fryer等[8]发现白人哮喘和特应性个体-403A等位基因频率高于正常个体,推断-403A与哮喘易感性和特应性有关。文惯宇等[9]也报道-403A可能是特应性体质的易感因素,但未发现RANTES-403G/A位点基因多态性与RSV毛细支气管炎的相关性。Amanatidou等[10]的研究则发现,RANTES基因-28C/G、-403G/A和Aln1.1T/C位点与RSV毛细支气管炎的易感性均无关,但基因型同时为-28C/C、-403G/A和Aln1.1T/T的个体易患该病。本研究结果显示温州地区RSV毛细支气管炎患儿和正常儿童均存在GG、GA和AA 3种基因型,两组基因型频率差异有显著性,RSV毛细支气管炎组RANTES-403A等位基因频率高于对照组,与携带G等位基因个体相比,携带A等位基因的个体患毛细支气管炎风险增加了1.415倍,提示RANTES-403A等位基因与RSV毛细支气管炎易感性相关,可能是影响RSV毛细支气管炎发病的一个重要候选基因。
  MCP-1编码基因位于人染色体17q11.2,由3个外显子和2个内含子组成,该段基因亦与哮喘等特应性疾病基因连锁。目前,MCP-1启动子区研究多的两个多态性位点为-2518G/A和-2076A/T。Rovin等[7]报道MCP-1-2518位点基因多态性影响MCP-1的转录及表达水平,MCP-1-2518G等位基因能使MCP-1转录增多,从而使其蛋白表达水平上调。Szalai等[11]发现MCP-1-2518G等位基因可增加婴幼儿哮喘的易感性,并与病情相关。目前国内外尚无MCP-1-2518G/A基因多态性与RSV感染发病的报道,本研究未发现MCP-1-2518G/A基因多态性与RSV毛细支气管炎易感性之间存在关联。
  综上所述,本研究结果提示RANTES-403A可能是影响RSV毛细支气管炎发病的一个重要候选基因,尽管未发现MCP-1-2518G/A基因多态性与RSV毛细支气管炎易感性之间存在关联,但RANTES和MCP-1位于同一染色体的同一区段,两位点所形成的单体型与RSV毛细支气管炎易感性是否相关,有待进一步探讨。另外,RANTES基因多态性只能部分解释RSV毛细支气管炎的易感性,本课题组其他研究发现TNF-α-308A等位基因、IL-8-251A与781C等位基因形成的AC单体型均与RSV毛细支气管炎的易感性相关,这些易感基因相互之间是否存在联合或协同作用,目前尚不明了,有待今后进一步研究。
  【参考文献】
  [1] Barbara Olszewska-Pazdrak, Antonella Casola, TadahitoSaito, et al. Cell-specific ex[x]pression of RANTES, MCP-1,and MIP-1a by lower airway epithelial cells and eosinophilsinfected with respiratory syncytial virus[J]. J of Virol, 1998,72(6):4756-4764.

  [2] McNamara PS, Flanagan BF, Hart CA, et al. Production ofchemokines in the lungs of infants with severe respiratorysyncytial virus bronchiolitis[J]. J Infect Dis, 2005, 191(8):1225-1232.

  [3] Noah TL, Ivins SS, Murphy P, et al. Chemokines and in-flammation in the nasal passages of infants with respiratorysyncytial virus bronchiolitis[J]. Clin Immunol,2002,104(1):86-95.

  [4] Murai H, Terada A, Mizuno M, et al. IL-10 and RANTES areelevated in nasopharyngeal secretions of children with res-piratory syncytial virus infection[J].Allergol Int,2007,56(2):157-163.

  [5] Garofalo RP, Pattu J, Hintz KA,et al. Macrophage inflam-matory protein-1a (Not T Helper Type 2 Cytokines) isassociated with severe forms of respiratory syncytial virusbronchiolitis[J].J Infec Dis, 2001,184(4):393-399.

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  [7] Rovin BH, Lu L, Saxena R. A novel polymorphism in theMCP-1 gene regulatory region that influences MCP-1ex[x]pression[J]. Biochem Biophys Res Commun,1999,259(2):344-348.

  [8] Fryer AA, Spiteri MA, Bianco A,et al.The-403G/A promoterpolymorphism in the RANTES gene is associated with atopyand asthma[J].Gene Immunol,2000,1(8):509-514.

  [9] 文惯宇,赵德育,田曼. RANTES启动子-403G/A基因多态性与呼吸道合胞病毒致毛细支气管炎的相关性研究[J]. 南京医科大学学报, 2007, 27(5):487-490.

  [10] Amanatidou V, Sourvinos G, Apostolakis S, et al.RANTESpromoter gene polymorphisms and susceptibility to severerespiratory syncytial virus-induced bronchiolitis[J]. PediatrInfect Dis J,2008,27(1):38-42.

  [11] Szalai C, Kozma GT, Nagy A, et al. Polymorphism in thegene regulatory region of MCP-1 is associated with asthmasusceptibility and severity[J]. J Allergy Clin Immunol,2001,108(3):375-381.