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临床检验仪器----临床免疫仪器

文章来源:www.3618med.com发布日期:2013-06-06浏览次数:28732

        免疫分析技术具有高度的准确性和特异性'因而在临床检验领域中备受重视,发展迅速,成为检验方法中为重要的技术之一。随着杭体和抗原制各技术的成熟及标记技术的发展和 完善,免疫分析技术作为疾病诊断的主要手段已被广泛应用于机体免疫功能、肿瘤标志物、内分泌功能、传染性疾病、治疗药物监测、过敏原检测等体外诊断实验中,其中血凝技术、酶联 免疫吸附实验技术、放射免疫分析技术、荧光免疫分析等已被大量地应用于日常工作。 由于临床检验工作量不断增加,疾病传染性对工作人员构成的危险因素加大,同时对工作效率要求越来越高,因此对检验自动化要求越迫切。20世纪70年代起自动生化分析仪开始出现在临床实验室,到了20世纪90年代免疫分析技术已日趋成熟,酶联免疫分析技术、放射免疫分析技术、免疫荧光等分析技术不断引入到免疫分析系统,这些免疫分析技术 不但有较高灵敏度,而且特异性也较好,具有一定的抗干扰能力。

        一、固相酶免疫测定仪 酶联免疫分析是一种酶标记技术,结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学
活性;酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,叉保留酶的活性。在测定时,受检标本(抗体或抗原)与周相载体表面的抗原或抗体结合,用洗涤的方法去除固相载体上形成的抗原 抗体复合物之外的其他物质,再加入酶标记的抗原或抗体,它们也通过相应反应而结合在固 相载体上。此时同相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例关系。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。用酶联免疫分析原理进行检测的仪器称为酶联免疫检
测仪(ELISA reader),简称为酶标仪

        (一)酶标仪的工作原理 酶标仪的基本工作原理就是分光光度法,酶标仪就是一台变相的光电比色计或分光光 度计。由于酶联免疫分析技术中使用的周相载体(试管、微孔板、小珠、微粒等)不同,因此可 以设计成不同的酶标仪,不同的酶标仪在结构上有很大的区别。这里必临床常用的微孔 板同相酶免疫测定仪为例介绍。酶标仪工作原理框图如图8-15所示。

 

        光源灯发出的光线经滤光片或单色器后成为一束单色光,陵单色光经过塑料微孔板中 的待测标本到达光电检测器,把光信号的强弱转变成电信号的大小,经前置放大、对数放大、 模数转换等模拟信号处理后,送人微处理器进行数据处理和计算,后将测定结果显示、打印m来。微处理器还通过控制电路控制X、Y方向的机械臂运动,变换检测样品孔。手动进样的酶标仪则由操作者手工移动微孔板,结构更简单。 图8-16所示是一种酶标仪的光路系统。光源灯发出的光经聚光灯、光栅后,到达反射 镜,经反射镜90。反向后,垂直通过比色溶液,再经滤光片到达光电管。酶标仪的光束可以 设计成从上到下或从下到上通过比色液。

 

        (二)酶标仪的基本结构 
         酶标仪有单通道和多通道2种类型。自动型多通道酶标仪有多个光束和多个光电检测 器,检测速度快。自动化酶标仪一般由加样系统、温育系统、洗板系统、判读系统、机械臂系 统、液路动力系统、软件控制系统等组成。

        1.加样系统包括加样针、条码阅读器、样品盘、试剂架及加样台等构件,加样针主要 是加样品和试剂,动力提供依靠液路动力系统,通过注射器样的分配器进行精确加样;条码 阅读器是帮助识别标本的重要装置;样品盘可放置标本、稀释管等;试剂架可放置酶标试剂、 显色液、终止液等试剂;加样台是酶标板放置的平台,有些仪器在台上设置温育装置,让温育在加样台上进行。整个加样装置南软件系统控制。 
        2.温育系统 由加温器及易导热的金属材料板架构成。一般温度控制在室温至50℃。 同样,温育时间及温度南软件系统控制。

        3.洗板系统由支持板架、洗液注入针及液体进出管路等组成。洗液注入针一般是8头,每次洗板残留液一般在5µl以内,好的可以控制在2µl内。

        4.判读系统由光源激光片、光导纤维、镜片和光电倍增管组成,是酶促反应终结果客观研读的设备。控制软件通过机械臂和输送轨道将酶标板送人读板器进行自动比色,再将光信号转换为数据信号又回送到软件系统进行分析,终得出结果。

        5.酶标板的移动靠机械臂或轨道运输系统来完成。机械臂的另一个重要功能是移动加样针,在软件系统的控制下,运动十分精确。

        6.酶标仪维护的重点是在光学部分,要防止滤光片霉变。应定期检测校正,保持其良好的工作性能。

        二、放射免疫测定仪
        放射免疫法包括放射免疫分析法( radioimmunoassay,RIA)和免疫放射分析法(immunoradiometric assay. IRMA).
放射免疫分析的基本原理是利用一定量的放射性核素标记抗原(*Ag)和未知量非标记的待测抗原(Ag)竞争结合其有限量的特异性抗体(Ab).反应达到平衡后,分离并分别测 定结合的抗原抗体复合物(*Ag.Ab)的放射性 与非标记抗原的含量之间存在竞争抑制的函数关系,通过已知浓度的标准曲线即可求出非标记抗原(待测样品)含量。标准曲线或竞争性抑制曲线如图817所示,以已知标准抗原的浓度为横坐标,以*Ag. Ab复合物的结合率(B%)为纵坐标,绘制m剂量反应曲线,未知浓度的待测Ag的量即从该曲线上求得。目前多采用计算机专用分析软件进行标准曲线拟合 和待测抗原浓度的计算。

        免疫放射分析法是将放射性核索标记在抗体上,然后以过量的标记抗体与待测抗原非竞争性结合,再将标}己的抗体抗原复合物(*Ag.Ab)与未结合的标|己抗体分离,对复合物的放射性作测量,并通过标准曲线求得待测抗原的含量。

        (一)γ免疫计数器 放射免疫分析和免疫放射分析常用的标记核素是”。I(发射7射线),在实验领域用来 测量”;I标记的放射免疫分析和免疫放射分析的仪器通常称为7免疫计数器。y免疫计数器通常由电源、同体闪烁探测器、电子线路、计算机系统和辅助设施组成(y免疫计数器的辅 助设施为J自动换样装置),如图8-18所示。

        1.探测器 根据设计原理不同,分为气体电离探测器、半导体探测器和闪烁探测器三大类。使川多的y免疫计数器是同体闪烁型探测器。工作原理是利用射线能量激发荧光 物质,在退激时释放出荧光的原理而设计的射线探测器。由固体闪烁体、光导、光电倩增管、 前置放大器和外周铅屏蔽组成。

        2.电子线路从探测器输出的电脉冲必须经过一系列电子单元线路处理才能被记录 和显示。常见的电子学单位线路有主放大器、脉冲幅度分析器和计数定量记录、显示装置等。

        3.电源有直流高压和直流低压。高 压电源一般在500-1000V可调,供光电倍 增管;低压电源较低,主要供电子学线路。

        4.计算机系统主要作用是采集数据和处理数据、分析数据、显示数据并适时对仪器进行自动控制。

        5.辅助设施不同的核仪器其辅助设 施不完全相同,γ免疫计数器的辅助设施是自动换样系统。通过计算机控制异步电机对测量样品管进行精确定位、换样。

(二)液体闪烁计数器
        液体闪烁计数器是在周体闪烁计数器的 基础上发展起来的,也是由探测器、电子线路、电源、计算机系统和辅助设施等部分组 成,如图8-19所示。 液体闪烁计数器与γ免疫计数器相仿,但比其复杂,原因在于探测对象为低能a,p射线,产生的光子较少,不能透过NaI( Tl)外 面的保护层,必须将样品加入闪烁液中,因此这种测量技术有利于探测样品中3H、14C等发射的穿透力极弱的低能口射线。目前液闪测量技术在生物医学领域中已广泛应用于 药物的吸收、分布、排泄、物质代谢、放射免疫 方面。

        三、免疫荧光测定仪
        图8-19液体闪烁计数器结构示意图
        生物大分子结构与功能的关系、遗传工程等免疫荧光技术( fluorescent immunoassay,FIA)是标记免疫技术中发展早的一种。 Coons等人于1941年采用荧光索进行标|已而获得成功。免疫荧光技术是20世纪70年代发展起来的,与放射免疫测定及酶免疫测定不同的是标记物和检测方法。免疫荧光 测定方法的标I己物是荧光索,用荧光分光度计测定荧光强度。80年代以来发展起来的时间分辨荧光免疫测定,克服了这些因素的干扰。时间分辨荧光免疫测定又称解离放大锕系荧光免疫分析( DELFIA).其标|己物不是荧光索,而是稀土金属镧系,如铕(Eu)。随着标记免疫分析的发展.时间分辨荧光免疫技术的先进性日显突出,可有效地排除非特异 荧光的干扰,极大地提高了分析的灵敏度。因此,我们对时间分辨荧光免疫技术作重点介绍。

        (一)时间分辨荧光免疫分析测量仪的基本原理 时间分辨荧光免疫技术(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是一种非放射性核素免疫分析技术,它用镧系元素标记抗原或抗体,根据镧系元素整合物的发光特点,用时间分辨技术测量荧光,同时对检测波长和时间2个参数进行信号分辨,可有效地排除非特异荧光的干扰,极大地提高了分析灵敏度。 时间分辨荧光免疫分析测量仪基本原理是以镧系元素铕螯合物作荧光标记物,利州这 类荧光物质有长荧光寿命的特点,延长荧光测量时间,待短寿命的自然本底荧光完全衰退后 再行测定.所得信号完全为长寿命镧系螫合物的荧光,从而有效地消除非特异性本底荧光的干扰。其测定原理如图8-20所示。其中增强液的作用是使荧光信号增强。因为免疫反应 完成后,生成的抗原抗体铕标记物复合物在弱碱性溶液中,经激发后所产生的荧光信号甚弱。在增强液中可至pH2~3,铕离子很容易解离出来,并与增强液中的p二酮体生成带有 强烈荧光的新的铕螫合物,大大有利于荧光测量。

        (二)时间分辨荧光免疫分析测量仪的基本结构 时间分辨荧光免疫分析测量仪所用检测仪器为时间分辨荧光计,与一般的荧光分光光 度计不同,采用脉冲光源(每秒闪烁1000次的氙灯),照射样品后即短暂熄灭.以电子设备控 制延缓时间,待非特异本底荧光衰退后,再测定样品发出的长镧系荧光。时间分辨荧光免疫 分析测量仪器基本结构如图8- 21所示(以DELFIAl230型为例)。 

         在系统中,氙闪灯是脉冲激发光源,激发光经两个石英透镜和一个滤色片把激发光束聚集到被测样品。每测量一个样品是南约1000次激发——测量循环组成的,由定标器累积记录荧光计数。反复闪烁的激发光能量的总和用光电二概管——反馈电路积分,当达到预置 的阈电压水平,闪烁灯的驱动器停止闪烁。激发光穿过样品管(孔)的侧面激发样品,而样品 的发射光则穿过孔的底部后被测量。光电倍增管输出的脉冲由一个前置放大器放大,然后 送到前置定标器,在测量周期完成后,微处理机读取定标器中的内容而且存储累积计数。后计数是这1000次循环中所测计数的累积。 
        四、化学发光免疫分析仪
        化学发光免疫分析是利用抗原抗体间免疫反应的高亲和力、高度特异性和化学发光的 高效率建立起来的一种微量免疫定量测定技术。标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫反应和操作步骤(如离心、洗涤等),品后以测定发光强度的形式测定待测物的含盘。 事实上,化学发光免疫分析定量测定技术由免疫反应系统、化学发光与检测系统三部分组 成,用免疫反应后的产物所产生化学发光信号来指示免疫反应物的存在与否及其含量的高 低,以此达到对抗原或抗体含量检测的目的。

        (一)吖啶酯标记的化学发光免疫测定仪
        吖啶酯类化学发光剂不需要催化剂的参与,在过氧化氢的稀碱溶液中即能发光,发射光的波长为430nm。

        1.仪器测定原理该仪器所用同相磁粉颗粒极微小,其直径仅1.0µm.大大增加了包 被表面积,增加了抗原或抗体的吸附量,使反应速度加快.也使清洗和分离更简便。其反应基本过程包括:

        (1)竞争反应:用过量包被磁颗粒的抗体,与待测的抗原和定量的标记吖啶酯抗原同时加入反应杯温育,其免疫反应的结合形式有两种,一是标记抗原与抗体结合成夏合物,二是 测定抗原与抗体的结合形式;

        (2)夹心法:标记抗体与被测抗原同时与包被抗体结合成一种反应形式,即包被抗体测
定抗原发光抗体的复合物。 上述无论哪种反应凡所结合的免疫复合物均被磁铁吸附于反应杯底部,上清液吸}f{后,再加入碱性试剂;其免疫复合物被氧化激发,发射出430nm波长的光予,再由光电倍增管将光能转变为电能,以数字形式反映光量度,计算测定物的浓度。

        2.仪器组成由主机和微机2部分组成。主机部分是仪器的运行反应测定部分,包括原材料配备部分、液路部分、机械传动部分、光路检测部分。微机系统是仪器的核心部分,是 指挥控制中心。其功能有程控操作、自动监测、指示判断、数据处理、故障诊断等,并配有光 盘。主机还配有预留接口,可通过外部存储器自动处理其他数据并遥控操作,用于实验室自 动化延伸发展。

        (二)过氧化物酶标记的化学发光免疫测定仪
        1.仪器原理(Vitros ECi全自动增强化学发光酶免疫分析仪)采用酶联免疫技术、生物索一亲和素技术和增强化学发光技术。它是用辣根过氧化物酶标记抗原或抗体、以子弹头 形塑料小孔管为固相载体,鲁米诺为化学发光剂,并加入化学发光增强剂,可使化学发光强度增强、时间延长而且稳定。

        2.仪器特点

        (l)采用一次性吸样头以防止标本间的干扰。

        (2) -次可以使用6个标本盘,检测标本60个。

        (3)仪器可与已有的LIS挂口相连,提高了实验室管理效率。 (cl)急诊标本可以在任意时间插入。 (5)通过2~3.点进行定标,可保持标准曲线28天的稳定性。

        (6)日常的保养由软件提示,大部分维护丁作自动化。

        (三)碱性磷酸酶标记的化学发光免疫测定仪
        ACCESS全自动微粒子化学发光免疫分析仪是碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析 典型代表。它采用微粒子化学发光技术对人体内的微量成分以及药物浓度进行定量测定。 该系统具有高度的特异性、高度的敏感性和高度的稳定性等特点。全自动操作,一次可以对60份标本进行24种项目的测定,只需10-30分钟就可完成个测定并打印出结果。

        1.仪器原理采用磁性微粒作为同相载体,以碱性磷酸酶作为发光剂,同相载体的应用扩大了测定的范围。以竞争法、夹心法和抗体检测等免疫测定方法为基础。试剂包装采用特殊的设计,每个试剂包有5个小室分别把不同的试剂分开,减少了交叉污染,保证了检测质量。

        2.仪器组成ACCESS是由微电脑控制的,由样品处理系统、实验运行系统、中心供给 系统和中心控制系统4部分组成。

        3.仪器特点
        (l)测定速度:每小时完成100个测试,从样品放人到个测试结果需要15~30分钟。

        (2)样品盘:可放置60十标本,标本管可直接上机,急诊优先,标本可随到随做,无须中断运行。

        (3)试剂盘;可容纳24种试剂,因此每个标本可同时测定24个项目,试剂可随意添加。

        (4)全自动条码识别系统:仪器能自动识别试剂盒和标本管条码,加快了实验速度。

        (5)灵敏度:通过酶放大和化学发光放大,灵敏度达到甚至超过放射免疫分析的水平。