高尔基磷酸化蛋白3在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

　　哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是细胞内磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/mTOR信号通路的中心调控点，与肿瘤细胞分裂生长和增殖相关，近研究结果显示高尔基磷酸化蛋白3(GOLPH3)通过激活mTOR，促进癌细胞增殖，是一种新的癌基因，且备受关注〕有关GOLPH3与结直肠癌组织的关系研究报道尚少。我们通过Westernblot等方法检测结直肠癌组织中GOLPH3的表达，探讨其与临床病理因素、mTOR和癌细胞增殖之间的关系。 　　

　　材料与方法 　　

　　1一般资料:2012年2月至2012年7月62例结直肠癌患者于福建医科大学附属第二医院接受手术治疗，术前均无化疗或放疗;年龄18一84岁，平均60.66岁;其中男38例，女24例。肿瘤部位:右半结肠11例，左半结肠12例，直肠39例;采用第7版AJCC/UICC结直肠癌TNM分期系统，其中I期5例，II期27例，IQ期30例，肿瘤细胞组织学:高、中分化腺癌51例，低分化腺癌或薪液腺癌11例。切取正常结直肠就膜(距肿瘤边缘10cm以上)作为对照组抗GOLPH3抗体、第二抗体、内参抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购自Abcam公司。 　　

　　2.Westernblot法检测:用二峰琳甲酸(BCA)蛋自定量试剂盒测定蛋白浓度，10%十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳进行分离，转膜，TBST+5%脱脂奶粉封闭，加人抗GOLPH3抗体，洗膜后加人二抗，洗膜后加人免疫印迹化学发光试剂(ECL)，显影、洗片。Westernblot结果均经过多次重复，用凝胶图像分析仪扫描照片。用Image-.1图像处理系统测定图片上每个特异条带灰度值。每个标本GOLPH3与内参GAPDH的条带灰度值的比值，作为GO1}PH3蛋白的相对表达量。免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶(SP)法根据抗体试剂盒说明进行实验操作。 　　

　　3.mTOR染色的判断标准:每例随机观察5个高倍镜(x400)视野。阳性表达细胞数<5%为0分，5%一24%为1分，25%一49%为2分，50%一74%为3分，,75%为4分。阳性细胞表达的着色深度:基木不着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色3分。 　　

　　两者得分相乘，,1分的病例判定为表达阴性，其余的病例判定为表达阳性。 　　

　　4.细胞核增殖抗原(Ki-67)增殖指数:随机选择至少5个高倍镜(x400)视野进行计数，每个视野计数500个细胞，计算Ki-67阳性细胞数占总细胞数的百分数，即为Ki-67增殖指数。 　　

　　5.统计学方法:应用SPSS13.0统计软件分析，采用t检验和方差分析(One-wayANOVA),GOLPH3表达与Ki-67增殖指数的相关性采用Pearson相关分析。 　　
　　结果
　　1.结直肠癌组织和正常结直肠载膜的GOLPH3表达:结直肠癌组织中GOI,PH3蛋白的相对表达量为0.76土0.59，明显高于正常乳膜GOLPH3蛋白的相对表达量(0.61士0.53,P<0.05，图1)。 　　

　　2.结直肠癌组织GOLPH3表达与临床病理因素的关系(表1):本组结直肠癌组织中GOLPH3的表达与细胞分化、淋巴结转移、临床分期明显相关，在细胞分化差、有淋巴结转移的结直肠癌组织中GOLPH3的表达量明显高于高、中分化、无淋巴结转移的结直肠癌组织(P<0.05),III期的结直肠癌组织中GOLPH3的相对表达量明显高于I一II期的结直肠癌(P<0.05)，而其他因素如年龄、性别、肿瘤位置、大体类型、肿瘤直径、浸润深度和血癌胚抗原(CEA)水平，结直肠癌组织中GOLPH3的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。 　　

　　3.结直肠癌组织GOL.PH3表达与mTOR表达、Ki-67增殖指数的关系:mTOR阳性表达定位于细胞质，呈棕黄色颗粒状，本组病例mTOR的阳性表达率为53.2%,mTOR阳性表达的结直肠癌组织中GOLPH3的相对表达量明显高于mTOR阴性表达的结直肠癌组织(P<0.05)，见表1oKi-67阳性表达定位于细胞核，呈棕黄色颗粒状，采用Pearson相关分析，结直肠癌组织中GOLPH3的相对表达量(0.76士0.5})与Ki-67增殖指数(0.46士0.17)呈正相关(r=0.325,p<0.05}。 　　

　　讨论
　　GOLPH3基因也称为GPP34,编码1种34000的蛋白质，是高尔基体复合物的一种相关蛋白，主要发挥蛋白质转运的作用。近来研究表明GOLPH3基因的扩增是导致结直肠癌等多种实体癌Sp13上的基因大量扩增的原因之一，且可促进人类癌细胞增殖，可能是一种原癌基因i}3]。因此，我们采用Westernblot等方法探索结直肠癌组织中(;OLPH3蛋白质表达及其与癌细胞增殖的关系。 　　

　　本研究结果表明，结直肠癌组织中GOLPH3存在过表达，与结直肠癌的恶性程度相关。在食管癌、乳腺癌、神经胶质瘤、多形性胶质细胞瘤等多种组织中存在GOLPH3的过表达，与低分化、临床分期、预后差相关，支持GOLPH3是1个原癌基因fa-}i，推测GOLPH3在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用。 　　

　　GOLPH3的过表达可调节高尔基体的蛋白质糖基化转移酶的定位而影响肿瘤相关蛋白的糖基化修饰川，通过控制核2乙酞氨基葡萄糖转移酶1(C2GnTl)在高尔基体的停留和影响豁附分子I(ICAM-I介导的E一选择素活化而降低细胞间的载附[gj，促进结直肠癌细胞的转移。 　　

　　本实验结果表明，结直肠癌组织中GOLPH3的过表达与mTOR表达、细胞增殖指数正相关，与文献报道一致[5j。GOLPH3过表达可增强表皮生长因子(EGF)引起的核蛋白S6激酶(S6K)表达水平升高，同时可通过丝氨酸473(Ser4730磷酸化激活AKT，刺激mTOR信号通路，加速细胞分裂}31，而封闭GOLI'H3基因表达可明显减少乳腺癌或横纹肌肉瘤细胞的增殖`~5'io},GOLPH3还可通过与Retromer复合体中Vps35作用，调节Wnt信号通路的活性促进增殖fs}al这些研究结果表明GOI,PH3是mTOR信号通路中的癌基因，有可能为结直肠癌的靶向治疗提供新的策略。 　　

　　本研究结果表明，GOLPH3在结直肠癌组织中存在过表达，与细胞分化、淋巴结转移、临床分期和irirOR表达相关，可促进结直肠癌细胞的增殖。 　　

　　参考文献 　　

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