化学脱细胞异体神经对大鼠坐骨神经缺损的修复

         与自体神经比较,目前仍然没有一种有效的临床替代物能接近其良好的修复效果,去细胞异体神经是自体神经移植替代物中有前景的一种.处理过的异体神经,去除了其可能引起移植排斥的细胞成分,但保留了天然神经复杂的内部结构,为神经再生提供了优良的微环境Z:.我们以SD大鼠为实验对象,观察化学脱细胞异体神经对大鼠坐骨神经缺损的修复效果.
         材料与方法 
         1.材料:雄性SD大鼠23只(河南省实验动物中心),体质量200一250g,NDI-200P+型肌电图诱发电位仪(上海海神医疗电子仪器有限公司),恒温振荡器(金坛市华城开元实验仪器厂),SXP-I手术显微镜(上海医疗器械股份有限公司),电子天平(上海精密科学仪器公司),脱氧胆酸钠(生工生物工程(上海)股份有限公司),TritonX-100液(北京克尔慧科技有限公司),神经丝蛋白200(NF-200)抗体(武汉博士德公司).
         2.化学脱细胞异体神经的制备:取成年雄性SD大鼠5只,10%水合氯醛腹腔麻醉,手术区域去毛,用乙醇棉球擦拭消毒,仰卧位固定于手术台.沿双侧下肢股部后外侧作纵形切口,钝性分离肌肉组织后暴露坐骨神经,单侧取的长度不少于2.5crn,显微镜下剥除神经外膜附带脂肪和结缔组织采用Sondcll等的方法处理取出的神经,处理完毕置入含有青、链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)中,4℃密封保存,每周换液苏木素一伊红(HE)染色鉴定内部脱细胞情况.
         3.实验动物分组和模型制备:其余18只SD大鼠,随机分成两组,自体神经移植组(A组)和脱细胞异体神经移植组(B组),每组9只所有大鼠10ale水合氯醛麻醉,无菌条件下暴露并切断左侧坐骨神经,造成Icm的缺损.手术显微镜(x10)下,A组将离断的自体神经段翻转后,用8-0号无损伤缝合线缝合于原缺口处,B组用长度为1cm的制备好的脱细胞异体神经连接缺口.缝合手术切口后,分开饲养,饲料和水任意取食.实验大鼠左侧均为手术侧,右侧暴露坐骨神经作为对照侧.
         4.大体观察:观察大鼠的精神状况、伤口愈合、手术侧足部肌肉萎缩和溃疡情况,是否出现并发症等;观察大鼠手术侧运动功能,是否出现拖地行走或者蜷缩行走等情况.
         5.坐骨神经功能指数(SFI):术后4,8,12周时,参照沈宁江等〔4的方法,采集每只大鼠的足迹,双侧均选取形状较好的足迹3个.分别测量第1趾到第5趾距离(TS),第3趾前端到足迹末端距离(PL),第2趾到第4趾距离(ITS).将以上3个变量带人Bain公式计算,SFI二一38.3(EPL一NPL/NPL)+109.5(ETS-NTS/NTS)+13.3(EIT一NIT/NIT)一8.8,以SFI二0为神经功能正常,一100为神经功能完全丧失.
         6.肌电图:术后12周,大鼠麻醉后充分暴露两侧的坐骨神经和胖肠肌.将记录电极置于小腿排肠肌肌腹中间,刺人深度适宜,用刺激电极分别刺激近端吻合口上端和远端吻合口下端,记录潜伏期和复合动作电位振幅,测量两刺激点间距离,得出神经传导速度.
         7.小腿三头肌湿重恢复率:肌电图检测进行完毕后,取出双侧小腿三头肌,纱布吸干表面血迹,用电子天平称重,公式计算.小腿三头肌湿重恢复率(%)(手术侧小腿三头肌湿重/对照侧小腿三头肌湿重)Xloo%.组织形态学:肌电图检测进行完毕后,分别切取两组大鼠神经移植体的中段和远端吻合口的远端,长度为7mm的2段神经.4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,纵行切片,行HE染色.观察神经移植体内部细胞,血管和神经纤维的密度及再生情况.
         9.统计学方法:应用SPSS13.0统计软件分析,采用两独立样本t检验.比较两组的SFI、小腿三头肌湿重恢复率、潜伏期、峰一峰波幅和神经传导速度等,数据均以均数士标准差表示.
         结果
         1.术后动物状态:大鼠术后苏醒即开始进食,明显步态不稳二术后2周时,术侧足部肌肉开始萎缩,少部分出现溃疡术后4周时,两组肌肉萎缩和溃疡情况均加重,足部蜷缩行走,无法支撑着地〕术后8周时,两组溃疡情况好转,A组肌肉萎缩逐渐恢复.术后12周,所有大鼠伤口愈合良好,无感染现象,溃疡完全消退,B组脚趾可以分开,无行走障碍,与A组在外形上无明显差异.
         2.神经移植物的大体观测:术后12周取材时,所有神经移植物均有不同程度的新生毛细血管出现,与周围组织有轻度粘连,但两组神经连续性良好,神经吻合口光滑,未出现明显膨大和神经瘤,外观与正常神经类似.
         3.SFI分析:术后各组SFI均随时间逐渐升高(图1),术后4周两组SFI值差异无统计学意义(P>0.O5),术后8周和12周A组的SFI高于B组,但差异无统计学意义(P>0.05).
         4.神经电生理分析:术后12周,两组的潜伏期、波幅和神经传导速度,A组结果均优于B组,但潜伏期和传导速度的差异无统计学意义(P>0.05),波幅的差异有统计学意义(P<0.05).
         5.小腿三头肌湿重恢复率测定:术后12周,两组术侧三头肌较对照侧均出现不同程度萎缩,术侧三头肌湿重恢复率见表1}A组的恢复率高于B组,差异有统计学煮义(P<0.05).
         6.HE染色、免疫组织化学和组织免疫荧光观察神经移植物内部结构:术后12周比较两组神经移植物:HE染色观察无明显差异,B组的神经移植物也出现了大量新生的束状纤维,两组连续性都很好,A组相对更致密,B组略微稀疏;免疫组织化学结果显示两组都有大量的阳性纤维丝,B组连续性很好,排列欠均匀,A组形态更接近于正常神经(C);组织免疫荧光检测可以观察到,两组几乎无差异,A组绿色荧光稍强于B组,但并不明显.
        

          讨论
         尽管自体移植代表着治疗复杂周围神经损伤的"金标准",但其表现出一定的临床限制.自体神经的获得会产生二次手术位点,且以牺牲有功能的正常神经为代价,导致供区感觉消失,可能发生神经瘤和神经痛Ls}l,同时增加了感染的风险,延长了时间然而利用化学方法制备的脱细胞异体神经,与临床上目前普遍采用的自体神经治疗方案比较,能够真正做到零损伤的治疗.化学萃取异体神经作为神经再生的支架具有多种优点:萃取后形成的网络样结构提高了自身的通透性,允许各种营养物质在管内外自由交换及血管长人,为神经再生提供有利的微环境;萃取后的基膜管去除了细胞成分,保留了细胞外基质和基底膜,具有极低的抗原性,同时保留了促进神经再生的营养成分;其管径与坐骨神经直径相似,避免神经卡压ul随着干细胞和转基因技术的发展,越来越多的研究者开始把目光转向应用更加复杂的组织工程技术来修复神经缺损.这些研究虽然在基础实验水平上已经获得了良好的效果,但距离应用于临床还有差距.将单纯的脱细胞异体神经支架应用于临床,却是可以考虑实施的.
形态学上的大体观察显示,B组在外观上与A组无明显差异.组织学水平可以直接观察到移植段神经内部的结构及其再生状态.在显微镜下,两组均可以观察到大量再生的神经纤维和雪旺细胞,B组的再生神经纤维的密度较A组略显稀疏.
         电生理检测中的潜伏期能够反映神经轴索中快传导纤维到达肌肉的时间,波幅则反映了参与混合神经肌肉动作电位的肌纤维数量,传导速度更直观的反映出神经干中快神经纤维的生理状态.术后12周,两组在潜伏期和传导速度上的差异无统计学意义,说明B组坐骨神经及其肌肉恢复的效果已经接近于A组.
         但B组在波幅上的轻微差异可能与肌肉的恢复效果不甚理想有关.同时,小腿三头肌湿重恢复率的数据结果也反映了同样的现象,说明B组在阻止失神经导致的肌肉萎缩效果上与A组有一定的差距.
         电生理和组织形态观察并不能完全的反映坐骨神经再生和功能恢复的情况,SFI是目前的一种较有效的行为学评价方法,可以很好的反映肌肉肌力的恢复.术后4周时,两组差距并不明显.术后8,12周时,两组SFI均有显著的升高,B组虽然整体上低于A组,但差异无统计学意义.
         本实验从不同水平对自体神经移植和化学脱细胞异体神经移植进行比较,可见异体神经移植对坐骨神经缺损的修复效果接近于自体神经,但对神经相应支配肌肉的功能性恢复上不如自体神经移植.虽然脱细胞异体神经移植仍然存在很多争议,但不失为一种好的替代自体神经移植的新方法.
         参考文献 张涵,袁芳,安沂华. 应用组织工程学修复周围神经损伤的研究进展[J].中华实验外科杂志,2005,(7):892-893.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2005.07.060.
         Hudson TW,Liu SY,Schmidt CE. Engineering an improved acellular nerve graft via optimized chemical processing[J].Tissue Engineering,2004.1346-1358.
         Sondll M,Lundborg G,Kanje M. Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction[J].Brain Research,1998.44-54.
         沈宁江,朱家恺. 评价坐骨神经功能的实验研究[J].中国矫形外科杂志,1995.191-193.
         Pfister LA,Papaloizos M,Merkle HP. Nerve conduits and growth factor delivery in peripheral nerve repair[J].Journal of the Peripheral Nervous System,2007.65-82.
         Zhang Y,Luo H,Zhang Z. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells[J].Biomaterials,2010.5312-5324.
         卫爱林,陶海鹰,刘世清. 三种脱细胞神经修复大鼠坐骨神经缺损效果的比较[J].中华实验外科杂志,2008,(3):374-375.doi:10.3321/j.issn:1001-9030.2008.03.036.
         Mackinnon SE,Novak CB.Nerve transfers. New options for reconstruction following nerve injury[J].Hand Clinics,1999.643-666.
         Moore AM,MacEwan M,Santosa KB. Acellular nerve allografts in peripheral nerve regeneration:a comparative study[J].Muscle and Nerve,2011.221-234.