除了基因测序还能干什么？揭秘下一代测序在生物医疗领域的其他应用

目前的下一代基因测序（NGS）市场，Illumina继续独占鳌头。自从推出HiSeq X测序平台以来，大幅度降低了基因测序的成本，即使是研究级全基因组测序的成本一直稳定在1000美元左右。至此以后，这一水平的竞争对手——华大基因的Revolocity测序仪也显得吃力。这也引起了许多研究人员猜测，长此以往会导致这一领域缺乏竞争力，导致NGS的发展（至少在短链阅读研究上）十分缓慢。但令人欣慰的是，NGS在其他领域的应用发展也十分迅速。
近日，Genetic Engineering & Biotechnology News对这些领域做了一次盘点，动脉网（微信：vcbeat）对主要内容进行了编译。
1.长链阅读技术

NGS在长链阅读领域有巨大的进展，揭示了基因组合转录的复杂性。在基因组的分析过程中，主要的问题是处理重复序列的DNA。如果序列重复的长度要长于基本阅读的长度，那么实现参考基因组的映射就会变得很困难，甚至是不可能。
无独有偶，基因转录的分析过程也面临同样的挑战。“大多数基因包含了多个外显子，以至于mRNA的长度比阅读范围的长度要长。”Personalized Healthcare 的Brenton Gravely博士表示：“因此，利用长链阅读来准确无误的了解特定样品中存在哪一种异构体，是不太可能的。”
Oxford Nanopore是一家备受关注基因测序公司。去年春天，Oxford Nanopore率先推出了基于纳米孔技术的测序仪MinION。尽管 后来Oxford Nanopore推迟了正式发布的时间，但公司已经确实将它的技术推广到大众。目前，超过1000家研究团队使用是MinION测序仪。
在初版本发布一年之内，通过对酶化学和纳米孔设计的一系列改进，MinION的生产量从不足1亿增长至超过10亿。从质量，产量和成本来看，MinION与Illumina还存在一定差距，但 Oxford Nanopore 的仪器却在两方面占有优势：阅读长度和可移动性。
在使用者的报告中反馈出，成千数万次阅读中的平均长度超过了10万。DNA的输入质量和预备存储似乎是限制阅读长度的真正的因素。也就是说，如果满足了输入质量和预备存储，就能够延长阅读长度。
同时，MinION还是一款可手持的测序仪，甚至可以在野外完成数据收集，不需要将处理后的样品带回实验室再进行分析。一开始，数据质量远远低于Illumina，但经过改进，数据质量已经大幅提高。新的R9 主打快捷模式，在理想环境下，测试的精度已经上升到95%。
太平洋生物是长链阅读测序的，近年也是成果颇丰。去年美国人类遗传学会上，公司公布了一个新的平台---Sequel。这个平台是与罗氏合作开发的成果，相比之前的RS II，在各个方面都有提升。
与RS II相比，Sequel的输出率更大，所占空间不到之前2/3，成本也只需要之前的一半。一直以来，太平洋生物科学公司都希望平台能够充分利用，解决化学和供应问题，特别是对可消费的SMRT（single molecule, real time）细胞。目前，这两个问题似乎都得以解决，公司正在等待批客户生成的数据反馈。
除了以上两家，行业内有影响力的还有GemCode的10X Genomics，可以从底层短链阅读数据生成连接。尽管这项技术还存在一些瑕疵，比如对于长于底层短链阅读的重复片段作用不大。但目前平台运作良好，今年早些时候还与Illumina 签订了联合营销协议，如果 Illumina的Moleculo synthetic长链阅读技术衰退，则协议开始生效。
尽管有所进步，但长链阅读技术，特别是基因转录测序，仍有问题仍急需解决。“而其中一个问题就是目前这些平台的吞吐量，但更大的问题是，逆转录酶的间断性还不够。”Gravely博士解释道：“在RNA直接测序中，性能优越的逆转录酶可以带来很大的改变。”
令转录研究人员兴奋的是，Oxford Nanopore在近发表的一篇论文中表明，他们正着手推出利用MinION 直接测序RNA的商业试剂盒。
2.单细胞基因组学

另一个应用就是单细胞基因组学。到目前为止，所有NGS项目（只有极少数例外）都是在混合细胞中进行的，即从上千乃至上万个细胞中对单个细胞进行测序。如果所有的细胞都是完全均匀的，那么所有细胞可作为一般情况下的体细胞基因组，这并不是一个问题。然而，许多应用程序中，并不是所有的细胞都是完全均匀的，需要集中汇集挑选关键信息。
例如，肿瘤活检就极富异质性，包含了体细胞和癌细胞。不仅如此，即使是同一个肿瘤的癌细胞也可能有不同的基因组。汇聚多个细胞，就会产生一个混合的基因组库，加大了解释和分析的难度。目前的研究水平，只有小部分的细胞变化是可以忽略不计的。
一开始，研究人员采取的策略是尝试在活检组织内部的几个不同的地方，分别采取几个单细胞进行测量。如果积累了足够多的个体测量，那么就可以建立一个全面的肿瘤基因组视图。
另一个方法就是单细胞途径。转录组是高度可变的细胞，将细胞聚集起来可以掩盖基因表达模式的潜在变异。
“就在几年前，上百个单细胞的转录学分析可能花费大量的时间和资源。”基因组学科学家Richard Shen近离开了Illumina跳槽到RS技术公司，他提到：“现在，随着简单易用的NGS文库技术的发展，大大降低了开发成本，分析上千个单细胞不仅成为现实，而且所分析得到的数据在许多应用中也显示了价值。”
对于单细胞库的制备，许多平台都可以实现：Fluidigm的C1，可以同时处理800个细胞；Chromium的10X Genomics，更是可同时处理多达48000个细胞。这样的处理能力，并不是每个研究人员的目的，Gravely 指出：“一些平台或者自制设备的吞吐量是非常让人兴奋的，我们所希望看到的是叠加效果，比如像holy grai这样的单细胞长链阅读测序仪。”
3.癌症液体活检

同样吸引人注意应用就是癌症诊断的液体活检。某种程度上，NGS在肿瘤活检领域的应用在正越来越普及。Foundation医学的FoundationOne测试就是好的例子。一个由315种相关癌症基因的标记组合成的单一测试面板。这些基本面板测试取代了传统的单一基因测试。
癌症诊断也在从肿瘤组织活检向液体活检偏移。不同于从肿瘤上切片提取DNA，癌症液体活检从循环肿瘤细胞（CTCs）或者患者血液中游离细胞中提取游离DNA（cfDNA）。就目前来看，由于提供了许多解刨和细胞结构的信息，肿瘤组织活检暂时不会消失，但是许多液体活检的研究人员表示，液体活检具有更多功能性。
“从癌症筛查的角度来看，液体活检更具有吸引力，因为他们不但更简单准确，而且可以进行癌症之前的常规检查。”Freenome联合创始人兼首席执行官 Gabriel Otte表示：“从预防和确诊病人的检测来看，液体活检同样具有优势，尤其是那些超过30%因为各种原因不适合侵入性活检的病例。”
作为一个热门的新领域，一些新兴企业正迅速成长，更多的大公司正在革新以占取庞大且不断增长的市场。
早在2014年，Guardant Health声称他们是个走向市场的液体活检企业。这一诊断被称为Guardant360。Freenome采取了不同的手段，通过测试癌症全基因组来实现癌症诊断。“我们依靠我们的深度学习。”Otte表示：“为了做出准确的癌症检测，我们根据相关的特定区域对做出了特定的分区。”
Illumina的测序技术已经被大多数公司利用，在这场竞技中，也推出自己的液体活检公司---Grail。也许是为了避免与自己的客户出现直接竞争，Illumina表示将主要围绕前期筛选，这个没有其他公司关注，且更具挑战性的任务。
4.纵向研究

随着液体活检的出现，监测研究性试验中肿瘤患者的反映，以及适当的样品跟踪已经变得越来越重要。这一过程，至少需要分析3种样品：肿瘤组织，正常组织和循环游离DNA。
当测序在的目标较大，比如对全基因组进行排序时，遗传指纹是可以被确定的，以至于在数据分析过程中样本可以进行适当的匹配。然而，Swift Biosciences生物学家Drew McUsic博士表示，当测序目标较小时，遗传指纹不能产生。
“直到现在，研究人员仍利用单核苷酸的多样性与LIMS系统排列配对来正确跟踪样本。”McUsic博士指出：“这些方法依赖于对多个样本的正确标记，以及数据文件与材料的精确匹配。”
为了寻找更精确的样本识别方法，Swift生物科技开发了一款Accel-Amplicon™ Sample_ID 面板。遗传指纹由104个外显子和性别特异性扩增子提供，作为低比例spike-in（待测样品中加入标准样，以检测你在实验操作过程中的样品损失），添加到任意一个Swift增扩平台，例如 Accel-Amplicon 56G Oncology Panel v2。McUsic博士还补充到：“从浅显的生殖