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纳米抗体结构剖析 l 对缺失轻链的适应

文章来源:健康界发布日期:2022-06-23浏览次数:52

1. 前 言  

与常规抗体VH相比较,在FR2区域,VHH有四个氨基酸突变,这是纳米抗体的特征。在常规抗体中,这四个氨基酸残基参与了与VL的相互作用,同时与常规抗体中所见的疏水相互作用位点相比,这些位点取代导致了VHH更高的亲水性。这一变化展现了VHH对其缺失轻链的适应。研究表明,该突变不仅对 VHH 的溶解度很重要,而且可能是 VHH 稳定性的关键决定因素。

2.1、VH与VHH之间的不同

VHH与VH相比较,显著的特征就是VH中的疏水残基被亲水残基所取代,这些被取代的残基原本参与了VH与VL的相互作用。VHH中亲水残基取代的区域我们定义为“前”VH-VL作用界面。VHH为了适应缺失轻链,得益于这些疏水残基被亲水残基所取代。

此外,VHH还有其他机制来适应其单域结构状态。首先,VHH通常具有更长的CDR3。VHH第三个结合环扩大弥补了因缺失轻链造成的影响。通常情况下, VH中的三个CDR形成抗原结合区域,而VHH中更长的CDR3不仅可以增大抗体和抗原接触面,还可以使得其结合基序多样性更高。VHH中更长的CDR3还可以深入到酶的活性中心裂隙,从而更好地抑制或者调节酶的活性,而这是传统抗体难以做到的,传统抗体通常在 VH 和 VL 之间的结合间隙中结合抗原。

2.2、VHH结构域中的“前”VH-VL作用界面

在传统抗体中,VH-VL之间的相互作用仅限于一些氨基酸残基。一般来讲,在VH有10个残基与VL相互作用,分别是S/H35,V37,Q39,L45,W47,F/Y91,A/L93,X95,F/Y100和W103 (X95为不保守的CDR3残基;F/Y100和W103均为CDR3残基)。S/H35,V37,A/L93和 X95与VL作用弱甚至无作用。Q39, L45, W47, F/Y91, F/Y100以及W103同VL作用紧密。大多数芳香族氨基酸残基形成疏水面,与VL发生疏水相互作用。

传统抗体的FR2中V37、G44、L45和W47这4个氨基酸残基是疏水性残基,在进化中是相当保守的。而VHH中,它们突变为亲水性的氨基酸残基F37、E44、R45、G47,增加了VHH的溶解性,这一特征被认为是VHH的独特标志。而这些取代也发生在VH与VL相互作用的位置。VHH与VH相比较,其他一些原本VH与VL反生相互作用的位置也发生了氨基酸的取代。表1显示了在VHs中与VL相互作用的残基,以及它们在700个VHHs中的分布情况,其中11位氨基酸残基也被统计的原因是在VH中该氨基酸残基与CH1发生相互作用,而VHH中缺失CH1。43和46位氨基酸残基因为存在于VH-VL接口处,没有直接与VL相互作用而同样被列入表1中。VHH中值得注意的还是四个氨基酸的取代,当然也有一些其他氨基酸,虽然没有四个氨基酸的取代那样保守,但是他们的替代同样也值得关注。而这些取代均主要是芳香族疏水性氨基酸残基被亲水性氨基酸残基所取代。

第11位的保守异亮氨酸(Leu)是VH和 CH1之间的球窝连接的一部分。在骆驼VHH中,由于缺失CH1,第11位异亮氨酸(Leu)极可能会由于疏水性质而发生突变,而这一突变确实在单峰骆驼(Dromedary)中被观察到(L11S),这就说明第11位氨基酸残基被替换为更小更亲水的氨基酸残基,有助于VHH的溶解性增加。不过在大羊驼(Llama)中,虽然同样缺失CH1,但是这一替换是不保守的,在我们的数据库中有84%的VHH第11为氨基酸为异亮氨酸(Leu)。这说明在大羊驼(Llama)中L11发生突变可能会对VHH结构产生影响,而单峰骆驼(Dromedary)可能克服这一问题。因此, L11在大羊驼(Llama)VHHs中的重要性是值得进行深入研究的。

第35位氨基酸残基,虽然与 VL的接触不是很紧密,但是也位于 VH-VL接口中。 研究表明,第35位氨基酸残基主要由丝氨酸Ser(人VH 中占40%)或组氨酸His(人VH 中占21%)占据,并且在 97% 的情况下,定位于抗原结合位点。在VHH中,该位点主要由丙氨酸Ala和甘氨酸Gly占据,表明该位点在VHH中的作用不同。在第27位和第29位引入两个体细胞突变热点可以将CDR1从VHs中的31-35位残基扩大到VHHs中的27-35位残基。这种CDR1向N末端的延伸可能导致第35位氨基酸残基在抗原结合中的作用不太突出。在VHH中第35位氨基酸残基可能在CDR1定向和连接两个β-折叠非常重要,G35的高频率出现支持这一假设。

“邻近区”由界面中的氨基酸残基定义,这些氨基酸残基接近抗原结合。第 35位和第95位氨基酸残基通常被认为是常规抗体中“邻近区”中重要的氨基酸残基。这些氨基酸残基通常与抗原结合有关,因此像D95这样的亲水性较低的残基丰度很高。Gly,Tyr和Ser残基也经常出现在第95位,这些残基可能是VH和VL之间形成疏水裂隙的原因。在美洲驼VHH中,第95位氨基酸残基也是高度可变的,但却是由带电的亲水性氨基酸残基占主导地位。这再次表明,虽然不那么明显,但这也是对于VHH对缺失VL作出的适应。

同样,通常在VH和VHH中第93位氨基酸为丙氨酸Ala。然而,在VHH中,该位置也有24%的氨基酸为天冬酰胺Asn。虽然该位点的突变不如其他位点那么明显,但这也使得VHH更加亲水。

第47位和第103位两个色氨酸Trp残基在 VH 和 VL 之间的作用中非常重要。如表1所示,W47在所有VHH 中均被取代,并被认为是骆驼重链抗体的标志。而W103在VHH中高度保守,所占比例高达95.8%。 这表明两个色氨酸Trp残基的功能完全不同。W47突变对增加VHH溶解性很重要,W103在VHH扮演着结构性的作用,可能对VHH正确折叠和内核稳定有关系。

在VH改造为VHH过程中,发现V37F突变对人VH热稳定有影响。Davies和Riechmann还认为对人VH的FR2突变,会影响稳定性和表达量。在一系列独立的实验中,获得的结果表明,FR2的突变(位于“前”VH-VL作用界面)对稳定性和表达量有影响。

2.3、突变增加VHH稳定性 在生理条件下(PBS buffer)进行噬菌体文库筛选,选择识别Malasezzia furfar(Malf1)细胞表面蛋白的VHHs。然而,这些VHHs的应用需要在高浓度的洗发水中发挥作用。所获得VHHs被证明在低浓度的洗发水中不能与Malf1结合。然而在有洗发水buffer的情况下进行筛选,获得的VHHs能够在洗发水中与Malf1结合,表明这些VHHs的稳定性大大增加。对这些VHHs的序列分析发现,“前”VH-VL作用界面的残基含有一些在VHHs中不经常出现的突变。

 氨基酸残基Q/E44是被认为是VHHs的标志的四个残基之一,与大多数VHs中的G44相比,属于结构性取代。在选择识别Malasezzia furfar(Malf1)细胞表面蛋白的VHHs时,发现几个结合良好的VHHs存在R44突变。突变Q44R导致VHHs在洗发水中的稳定性增加,而R44Q则显著降低VHHs在洗发水中的稳定性。此外,R44K并不影响在VHHs在洗发水中的结合,但是当pH值为11时,VHHs在洗发水中的结合能力减弱,因为K44的质子化程度较低。这表明,带正电荷的R44对VHHs在洗发水中的稳定性具有促进作用,电荷在VHH的这个区域很重要。

2.4、溶解度与稳定性

VHH1被证明能够在体外和体内抑制轮状病毒,为了提高中和轮状病毒的VHH的蛋白质溶解稳定性,进行了突变筛选,。突变体R27A显示出对胰蛋白酶的稳定性增加,热稳定性增加,产量水平增加,亲和力保持不变。  

另外两个突变体是在“前”VH-VL作用界面上产生的。第一个突变体R45A未表现出明显变化,其对胰蛋白酶敏感性不受影响,亲和力不受影响,表达水平略有下降,热稳定性略有下降。这表明尽管R45的保存率很高,达到97%,但某些突变可能对VHH稳定性不会产生明显的影响。

氨基酸K43位置的突变,也是高度保守的,占86%,确实对稳定性产生了巨大的影响。虽然T43存在于所有VHHs中的4%,但由于细胞内的积累,K43T导致生产水平非常低。产生这种突变体的酵母细胞的细胞内部分在考马斯亮蓝染色的凝胶上确实显示出VHH的积累,然而,这种部分不能被纯化,可能是由于聚集。这表明分泌受到严重阻碍,这可能是由不适当的折叠造成的。  

与野生型H14相比,突变体H14M(K43T和E44R)的mRNA表达量下降了三倍,与野生型R2的mRNA水平相比,突变体R2M(K43T和E44R)下降了两倍多。作为对照实验,测定了针对Malf1的VHHs的mRNA水平。四个VHHs,两个含有T43R44(D12和A7M),两个含有T43Q44(D12M和A7),显示的mRNA数量大致相等。这表明所做的突变没有引起mRNA的急剧不稳定。


D12、A7和2个突变体的Northern印迹。左上角是RNA凝胶电泳图;在右上方的角落是相应的Northern印迹;底部是体积计算和相对密度。

尽管H14M和R2M的mRNA不稳定,但少量的突变体VHH蛋白可以被纯化,并在洗发水中测试其稳定性。但这些突变并没有导致VHH-R2和VHH-H14在洗发水中的结合力增加。,虽然这些残基已被证明对洗发水中的稳定性很重要,但它们并不是这种稳定性的决定因素。

由于密码子的使用被证明对mRNA的稳定性有影响,可能是密码子的使用对这些突变体不是好的。malf-D12使用的密码子是ACC(T),CGG(R),而H14M和R2M使用的密码子是ACG(T)和CGG(R)。因此,R44的密码子的使用不可能完全导致mRNA的不稳定,尽管这个密码子是在酿酒酵母中不常用的Arg密码子(1.7/1000)。在酿酒酵母中,Thr的密码子使用量为ACT(20.2)、ACA(17.7)、ACC(12.6)和ACG(8.0)。H14M和R2M的密码子使用情况与malf-D12的密码子使用情况相比,在酿酒酵母中的生产情况不那么理想。这可能是对mRNA稳定性下降的一个解释。然而,mRNA的稳定性很复杂,这可能不是不稳定的原因。   为增加蛋白水解稳定性而构建的抗轮状病毒VHH1的突变体K43T,也显示出蛋白生产水平的急剧下降。为了排除在H14和R2的突变体中看到的mRNA稳定性的下降导致产量下降,我们测定了mRNA的表达水平。图3显示了为降低胰蛋白酶敏感性的突变筛选而产生的八个突变体的Northern印迹。   图3显示突变体K43T的mRNA没有明显下降。这表明分泌受阻是由于蛋白质水平的问题,并进一步支持这一突变导致折叠问题的假设。

3. 小 结  

VH-VL界面相互作用的残基是高度保守的。这些残基通常是VH中大的、疏水的和芳香族的残基,具有与VL相互作用和形成结合裂隙的特殊功能。如果没有任何进一步的实验论证,人们可能很轻易地认为,在缺乏VL的VHHs中,这些残基的重要性较低,保守性也较低。然而VHHs中的这些残基具有更高的可变性,这些残基的重要性表现在通过将疏水残基替换成更亲水和常带电荷的残基。

疏水残基到亲水残基取代的一个特殊例外是W103。这个大芳香族分子和非常疏水性的残基在96%的VHHs中也可以看到。这意味着W103在VHHs中的作用与 "前 "VH-VL界面中的其他残基不同。

从VH到VHH观察到的替换明显增加了亲水性。在这里,我们为 "前 "VH-VL界面中的残基的更广泛的功能提供了证据这些残基,特别是亲水的KEREF/L延伸部分的残基是决定VHHs稳定性的关键因素。对残基分布的研究显示,该区域的替代率高。此外,第43、44和(在较小程度上)第45位的突变对稳定性有极大的影响。这表明,这些残基在VHHs的稳定性中具有关键作用。