从血液中探索更多的可能性—ctDNA NGS临床实践专家共识

肿瘤的基因检测中，不少项目的金标准都要依托组织样本，例如PD-L1蛋白表达，HER2的扩增等。但对于有些患者而言，想要做相关的检测却会面临无组织可取或组织样本不够的局面，在有限的选择情况下，液体活检尤其是ctDNA的高通量测序逐步发展填补了这块的检测空缺，给不少有检测需求的患者尤其是晚期患者带来更多希望。

2022年6月份，中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会发布了《ctDNA高通量测序临 床实 践 专家共识（2022 年版）》，文章就ctDNA概述，ctDNA NGS检测的临床应用，ctDNA NGS检测的标准形成7条专家共识，以供临床和检测进行参考。

ctDNA（circulating tumor DNA）的来源有主要由三种途径：细胞凋亡，细胞坏死以及活跃的细胞分泌活动产生，当这些DNA从肿瘤进入到血液循环系统后便可通过外周血从采集到进行检测。这些游离的DNA片段长度一般在132~145bp之间，并且半衰期较短（一般<2h），并且会有大量的其他来源DNA干扰，如其他正常细胞或白细胞来源的DNA，与ctDNA一起被称为游离DNA（cell free DNA，cfDNA）。

与组织学检测相比，ctDNA检测具有无创或微创，可反复取材，收集、处理和分析报告周转时间短等优势，同时能克服肿瘤空间异质性，可相对全面地实时反映患者的肿瘤分子特征。 与单独组织活检相比，血浆ctDNA还可增加驱动基因突变检出率。 利用ctDNA的优势，临床上可展开多种应用。

应用场景

1.伴随诊断：目前已有临床证据支持ctDNA NGS检测可应用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等晚期实体肿瘤的伴随诊断，但涉及的驱动基因及其变异类型与相应分析体系均有严格限定，若超适应症应用时，建议与患者就检测必要性、检测费用以及局限性等内容进行充分知情。ctDNA NGS检测已被国内外专家共识或指南建议作为多种晚期恶性肿瘤组织基因检测的替代方式，但依据其分析结果实时制定临床治疗策略时仍需循证证据支持。（共识2）

2.肿瘤治疗疗效评估及预后风险分层：晚期实体肿瘤分子靶向或免疫检查点抑制剂治疗开始后，基于NGS检测的ctDNA水平定量和动态变化分析，有望成为新兴的疗效评估途径。ctDNA MRD 检测是全新的个性化技术应用领域，尚难以建立通用性技术标准，亟待通过大样本、多中心、前瞻性的临床试验验证其临床效用。ctDNA NGS检测在临床上用于靶向或免疫治疗评估和分层时，建议就检测价值、局限性和费用等进行充分知情。（共识3）

3.用于肿瘤获得性耐药机制分析：在临床环境中，ctDNA NGS检测可用于识别分子靶向治疗的耐药机制，尤其对于疑难复杂的肿瘤患者，该结果有助于后续的治疗选择决策。免疫检查点抑制剂治疗获得性耐药机制复杂，治疗选择压力下的肿瘤亚克隆演进仅为其部分原因，ctDNA靶向测序、全外显子和（或）全基因组检测仅作为其转化研究工具之一。（共识4）

虽然ctDNA的NGS检测具有多种优势和多样的临床应用，但相比于组织检，ctDNA的检测的条件更为苛刻并且对产品的性能有更高的要求。在“共识1”中也指出，：ctDNA作为肿瘤细胞主动分泌或肿瘤细胞在凋亡或坏死过程中释放入循环系统的DNA片段，其丰度受多种因素影响，波动较大，在内外因素特别是治疗压力下，其携带的生物信息可能会发生演变，且受正常细胞胚系变异或克隆性造血细胞体系突变干扰，在临床检测和报告解读过程中应特别注意。 因此围绕ctDNA的NGS检测，也有相应的标准供各检测实验室参考执行。包括对实验室场地耗材，实验室体系构建，样本采集、处理原则，NGS检测技术要点，生信方法，报告要求均有一定的标准用于规范项目的执行。围绕这些标准有以下三点共识： ctDNA NGS检测实验室质量管理需贯穿全程，ctDNA收集、样本处理和自动化过程应按照标准化和临床验证程序进行，大程度防范因操作差异而引发的假阴性可能。样本采集建议采用含细胞稳定剂的抗凝管，尽快完成血浆分离，提取的cfDNA建议在24 h内进行后续检测，否则，置于-30 ℃至-15 ℃下储存并避免反复冻融。（共识5）

ctDNA NGS检测应根据项目需求选择技术路线，可依据检测基因数量及覆盖范围大小选择不同测序策略。 在进行基于ctDNA的超高灵敏度突变检测时，建议使用分子标签技术和优化对应的生物信息分析设置，以降低由于测序平台随机误差导致的假阳性结果； 建议通过建立测序噪音和克隆性造血背景库的方法降低克隆性造血及背景噪音带来的影响。 （共识6）

ctDNA NGS临床检测报告应包含受检者基本信息、样本信息、实验室信息、检测项目、检测 结果及变异解读、检测方法的实验室内部验证结果、检测局限性及不确定性以及进一步检测的建议等内容。实验室应建立报告SOP，建议根据国内外文献、共识指南、临床试验证据和实践对检出的肿瘤基因突变进行分类或分级报告。（共识7）   

除了严格执行标准进行试验，ctDNA的检测情况还与很多其他因素有关。例如患者的病情进展情况，对于大多数实体恶性肿瘤，血浆中的ctDNA水平较低，突变等位基因分数在晚期转移性疾病中通常低于10%，在局部晚期非转移性疾病中低于1%。ctDNA水平在癌症早期和治疗后更低，其突变等位基因频率通常小于0.1%。而就同一个体而言，不同时段释放到血液循环系统里的ctDNA量也有差异，这些均有可能影响结果的检出情况。所以，即使在液体活检技术已有较长时间的发展，就ctDNA的NGS检测而言，依然有非常大的进步改善空间。