端粒DNA延长关键复合物的冷冻电镜结构

端粒是位于真核细胞线性染色体末端由重复DNA序列及保护蛋白构成的复合物。端粒的存在解决了线性染色体的“末端复制问题”，对于保持真核细胞基因组的稳定性和完整性具有重要作用。在成体细胞中，端粒DNA的长度会随着细胞分裂次数的增加而逐渐缩短，引发细胞衰老和死亡。

而在胚胎干细胞和癌细胞中，缩短的端粒DNA被延长，从而保持细胞的“永生”。因此，自端粒发现以来，其功能和延长机制一直是细胞衰老、干细胞和癌症研究的热点。

端粒DNA包含一条富含鸟嘌呤重复序列的G链 (人的序列为TTAGGG) 和与之互补配对的C链。这两条链的延长需要四个关键复合物的参与协同进行：

(1) 位于端粒末端的shelterin复合物首先通过TPP1蛋白直接招募端粒酶 (telomerase)；

(2) 端粒酶利用自身携带的RNA模板连续合成数十个重复序列，对G链进行延伸；

(3) 随后shelterin招募由CTC1–STN1–TEN1构成的CST复合物终止G链的合成；

(4) CST招募DNA聚合酶α–引物酶复合物 (DNA polymerase α–primase, PolαPrim)，利用新合成的G链作为模板，合成与之互补配对的C链。

近两年随着样品制备和冷冻电镜技术的进步，Juli Feigon及其他几个研究组先后报道了四膜虫和人源端粒酶的高分辨率结构。这些结构揭示了端粒酶被TPP1招募，以及端粒酶连续合成G链重复序列的结构机制。然而人们对于随后CST招募PolαPrim进行C链合成的理解仍然受限于相关复合物结构的缺失。

2022年7月13日，加州大学洛杉矶分校 (UCLA) 的Juli Feigon组和周正洪组合作 (何垚博士和宋贺博士为共同第一作者) 于Nature在线发表了题为Structure of Tetrahymena telomerase-bound CST with polymerase α-primase的研究成果。该文章报道了结合在四膜虫端粒酶上的CST在结合PolαPrim前后的冷冻电镜结构，为理解端粒DNA G链和C链协同合成的分子机理提供了关键的结构基础。

与哺乳动物的CST不同，四膜虫的CST通过p50 (TPP1在四膜虫中的同源蛋白) 连接在端粒酶核心上，三者共同参与构成了四膜虫端粒酶复合物。在此研究中，作者将原位纯化的四膜虫端粒酶和重组表达纯化的四膜虫PolαPrim混合，在体外组装出包含端粒酶核心、p50 (TPP1)、CST和PolαPrim这四个端粒DNA延长关键组分的“超级”复合物。

接下来的功能实验证明该复合物可以通过端粒酶核心延长G链，并利用新合成的G链作为模板通过PolαPrim合成互补的C链。针对该复合物及其组分的单颗粒重构解析了端粒酶 (2.9 Å)、端粒酶–CST (3.5 Å)、CST–PolαPrim (4.2 Å) 及PolαPrim (4.0-4.3 Å) 等一系列冷冻电镜结构，进而揭示了这些关键组分之间相互作用的结构机制。

 这些结构显示，四膜虫CST中的Ctc1亚基包含三个OB结构域，其中位于N端的OB结构域通过与p50相互作用将CST锚链到端粒酶上。CST的另外一侧与PolαPrim中的DNA聚合酶亚基POLA1相互作用，形成了一个孔道，连通了结合在CST上的G链模板和位于POLA1上的合成C链的活性中心。在结构解析的过程中，作者发现CST相对于p50的位置并不固定，而是处于连续变化的过程中。通过结合冷冻电镜和核磁共振方法各自的优势，作者展示了CST与p50完整的相互作用界面，揭示了两者柔性连接的结构基础。 

与该文章同时发表在Nature上的还有两篇针对人源CST–PolαPrim的结构  和功能 研究。连同稍早些时候报道的人源CST–PolαPrim处于招募阶段的结构  ，这些结构互相印证、互相补充，为充分理解端粒DNA延长的分子机制提供了坚实的结构基础。