混合益生菌制剂及其代谢产物可通过调控肠道微生态缓解DSS诱导结肠炎

I BD是发生在胃肠道内的慢性非特异性炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病两种疾病类型 [1] ，大部分患者的临床表现为腹痛，腹泻，血便，肛周病变，伴有体重降低，营养不良等 [2,3] 。IBD易反复发作，难以治且有很大风险会发展为结直肠癌（Colorectal cancer ,  CRC），虽然通常被认为是西方国家常见的肠道炎症性疾病，但近年来，在发展中国家，该病的发病率正在加速上升，严重增加 患者的 疾病负担及损害生活质量 [4–6] 。IBD的确切发病原因至今仍不明确，但已有较多证据认为，该病是基因，环境多方面复杂因素共同作用的结果，同时，持续的肠道感染、肠黏膜免疫调节异常和肠道微生物群失调对IBD的发生发展也密切相关。其中，肠道微生物群被报道出是疾病进展的关键因素之一，结肠炎个体的肠道菌群组成（类型和数量）与健康个体不同，会激活宿主免疫反应，这会增加肠道的通透性并破坏肠黏膜的屏障结构，进而破坏共生微生物并激活严重的免疫反应，导致 疾病 反复发作 [7–9] 。 众所周知，益生菌是定植于人体肠道以对肠道产生有益影响的活微生物，作为益生菌的两个主要属，双歧杆菌和乳酸杆菌由于能介导短链脂肪酸的形成也被报道出对IBD和 C RC症状的改善具有潜在益处 [10] 。除此之外，乳酸杆菌和双歧杆菌还能通过增加健康益生菌对肠粘膜的粘附、抑制病原体粘附在粘膜表面、竞争性排除病原微生物、产生抗菌物质和调节免疫功能来重建肠道共生及保护肠道粘膜 [11] 。而本次研究所用的益生菌 专利菌株 包括罗伊氏乳杆菌，格氏乳杆菌，嗜酸乳杆菌和乳双歧杆菌 ， 它们分别属于乳杆菌属和双歧杆菌属，该菌混合制剂配方符合国家食品添加标准。尽管已有研究证明这四种菌在宿主体内具有积极作用。然而，该菌及其代谢产物在葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium ,  DSS）诱导结肠炎中的综合作用尚未清晰地评估比较，潜在的机制也仍须进一步阐明。

实验设计与结果

本研究 采用14周龄小鼠建立DSS诱导的结肠炎模型，实验周期为14天。根据实验条件将小鼠分为7组 ： CONTROL , control   group; MIX , probiotic consorti a ; LR1 , Lactobacillus reuteri  PLBK ® 1 group; LR2 , Lactobacillus reuteri  PLBK ® 2 group; LG , Lactobacillus gasseri  PLBK ® 3 group; LA ,   Lactobacillus acidophilus  PLBK ® 4 group; BL , Bifidobacterium lactis  PLBK ® 5 group 。 其中，6组实验组的小鼠需要每天灌胃相对应的单菌株或者 益生菌混合制剂 ，在整个 益生菌干预 实验过程中，每天记录体重、粪便硬度变化、血便情况等实验指标，另外，在第8天和第14天需要收集粪便进行16S rRNA测序，小鼠处死后还需要收集结肠组织以便进行后续 苏木精和伊红（ Hematoxylin and eosin, H&E ） 染色和 免疫组织化学（ Immunohistochemistry, IHC ） 实验 。 通过分析发现 益生菌制剂 减轻了小鼠结肠炎的病理症状。与对照组相比，MIX组能改善DSS引起的结肠缩短  ,减轻了体重的变化波动 并降低了 疾病活动指数（ Disease Activity Index, DAI ） 的评分  ，另外，可以观察出单菌株组对于体重变化和DAI评分的降低效果不如 M IX组 。

益生菌制剂可缓解 DSS 诱导实验性结肠炎的病理症状 对结肠切片进行H&E染色以评估结肠粘膜损伤情况，从对照组的结肠切片可发现肠道结构和屏障发生了破损。相比之下， 益生菌制剂 的处理对结肠具有保护作用，且组织学评分也较低。另外，尽管在单菌株组中仍可以观察到炎症，但是大部分的隐窝结构是正常的，尤其在LA组，表现为较低的结肠病理学评分 。 进一步利用免疫组化，以检测与炎症有关的巨噬细胞标志物-F4/80 ， 处理结果与H&E染色结果一致，与对照组相比， M IX 组 的F4/80水平明显降低 ，表明先天免疫细胞向结肠的浸润减少 。

益生菌制剂保护DSS诱导结肠炎模型的肠道结构并抑制巨噬细胞的浸润 将 粪便样本进行16S rRNA测序 以探究 益生菌菌株对结肠炎肠道菌群 的 调节作用。结果发现，在不同的实验时期，7组肠道微生物群的组成在物种水平上存在差异  ， 且与对照组相比， M IX组在第8天的Simpson指数不同，而其他单菌株组则无差异 ， 表明 益生菌制剂 干预能对群落组成和多样性产生影响，从而进一步加速了炎症的恢复。此外，无论在第八天还是14天，β多样性都显示出，对照组和 M IX 组 的肠道微生物群被明确地分为两个集群，而第八天单菌株组的差异则  ，这些结果表明，与单菌株相比， 益生菌制剂 处理对肠道炎症持续期和恢复期的肠道菌群都具有调节作用。且对照组和MIX组在两个阶段也显示出明显不同的细菌成分组成  。

益生菌制剂重构肠道微生物群的组成 除此之外，为了在肠道炎症期间进一步识别起作用的微生物标志物， 该研究 主要对MIX 组 和对照组分别在第8天和第14天采取随机森林 结合 5倍交叉验证算法 （ Random forest analysis and 10   trials of 5-fold cross-validation, RFCV ） 来进一步识别特征细菌  。分析后发现有差异的菌为 1 1株，在 8 天有7株菌  ，在第14天有4株菌 ， 其中，有 8 株菌株在单菌株组中并无统计学差异 （补充图）， 这些数据表明， 益生菌制剂 极有可能通过对肠道微环境的特异性调节而发挥综合作用。 为探究对照 组 和MIX组中菌群与表型之间的相互作用，还分析了共发生网络图，结果发现通过RFCV筛选出来的 4 株关键菌在三个网络图中 均可 发现，且第 8 天显示较为复杂的互作网络关系 ，提 示这4株关键菌在 益生菌制剂 调控肠 道微生态和疾病表型中的重要性。

通过随机森林鉴别结肠炎小鼠模型中的标志性肠道微生物群 考虑到益生菌制剂 除平衡肠道菌群之外，还能产生大量的代谢物并被肠上皮细胞吸收，为了进一步 探究 该 益生菌制剂 的代谢产物对结肠炎的影响， 该研究 将 未纯化的 益生菌发酵代谢产物应用于结肠炎模型。由于 益生菌制剂 的效果优于单菌株，因此 代谢产物干预 仅 对照和混合代谢物 两组：对照组 和混合代谢产物的 MIX组。并在第14天收集小肠（Small intestine, SI）内容物  。 分析 发现 ， 对照组由于DSS处 理 ，导致 了 结肠缩短  ，体重变化较大  ，而混合代谢产物则明显降低了DAI评分  ，提高了生存率 。同时，在对照组中，H&E染色和IHC的结果显示出DSS处理引发了隐窝损失、粘膜破坏以及F480的表达增多  ，而这些情况在经过混合代谢产物的干预后都得到了明显的缓解。另外，通过对比 益生菌 干预实验的表性结果，可以发现 益生菌制剂 比混合代谢物更能有效地减轻体重损失和粘膜损伤。

混合代谢物减轻结肠炎小鼠模型的结肠损伤 为探究 代谢物处理 对 微生物群 的调节作用 ， 该研究还 对 混合代谢产物 干预中收集的粪便进行16S r RNA测序。结果发现，在第14天，两组结肠粪便样本的多样性及在 益生菌 干预中筛选出的关键菌同样都没有统计学差异  ，另外，共发生网络图也显示出关键菌在网络结构中大多表现为孤立的点  。提示混合代谢产物对结肠菌群调节的能力较小，同时结合文献研究发现，近端小肠是微生物代谢物吸收的主要场所 [12,13] ，因此假设混合代谢物可能更 有效 地影响小肠中的细菌。为了验证 此 猜想， 本研究 对小肠内容物进行了16S r RNA测序 ， 发现MIX组和对照组的β多样性存在性差异  。对核心菌群 的 热图分析发现两组中的菌群存在明显不同  。这些结果支持 该 假设， 即 混合代谢物改变 了 小肠的细菌 组成和结构 。

在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中，混合代谢物干预在特异性调节肠道微生物方面次于益生菌制剂 总体而言， 目前的 研究证明，罗伊氏乳杆菌 PLBK ® 1，罗伊氏乳杆菌 PLBK ® 2,格氏乳杆菌 PLBK ® 3，嗜酸乳杆菌 PLBK ® 4和乳双歧杆菌 PLBK ® 5的 混合 益生菌制剂 干预 可减轻结肠炎肠道炎症，通过对肠道细菌水平的调控使结肠炎小鼠失调的微生物群组成和功能得以改善，且证明了肠道菌群和结肠炎表型之间具有复杂的相关性。为益生菌 在 维持肠道健康方面提供新见解，并将促进IBD和其他炎症性疾病的预防和治疗策略的发展。 五株专利菌株的微生态制剂产品（白云山和黄药业联合出品的三高伴侣 ® 微生态制剂），目前在新乡医学院附属第一医院消化科正在开展IBD和UC患者的微生态直接临床干预研究（伦理编号：[ 2001]伦科快审字 (23)号 ）。