基质弹性调节培养中的骨骼肌干细胞的自我更新

天然存在于成体组织中的干细胞，如肌肉干细胞（MuSCs），在体内表现出强大的再生能力，而一旦培养则会迅速丧失。因此美国和瑞士研究人员P. M. Gilbert等使用生物工程基质模拟关键的生物物理和生物化学微环境特征，结合高度自动化的单细胞跟踪法，证明基质弹性是培养中MuSCs命运的强力调节因子。与硬塑料（约106 kPa）上培养的MuSCs不同，在模拟肌肉弹性的软水凝胶基质（12 kPa）上培养的MuSCs会在体外自我更新，并且进一步移植到小鼠体内后，通过无创生物发光成像进行组织学和定量分析发现，MuSCs还可广泛促进肌肉再生。再次证明通过模拟生理组织硬度，可实现成体肌肉干细胞的繁殖，对未来的细胞疗法有极大启发作用。

背景

许多成体组织含具有明确特征及再生能力的干细胞。如果干细胞在分离后立即从一个个体移植到另一个个体，这种特性将被保留，而治疗应用中，一旦干细胞置于平板培养以增加其数量，这种特性就消失了。当移植到小鼠体内时，肌肉微环境（niche）使新分离的肌肉干细胞（MuSCs）能广泛促进骨骼肌再生。而标准组织培养塑料板上生长的MuSCs则失去了“干细胞性”，获得的祖细胞再生潜力和治疗潜力都大大降低。尽管对生化信号进行了广泛研究，但目前仍无法实现对包括MuSCs在内的培养中的功能性成体干细胞进行繁殖。已知生物物理特性如基质硬度可改变培养中细胞的分化。本研究测试了一个假设，即弹性模量在肌肉干细胞自我更新及其在肌肉再生中的功能中发挥关键作用。研究发现当MuSCs培养于模拟肌肉组织硬度的基质上时，可自我更新产生具有修复受损肌肉潜能的干细胞，可有助于克服成体干细胞治疗应用上的一个主要障碍。与诱导多能干细胞（iPS）或必须定向分化的胚胎干细胞不同，该策略利用了具有确定特征和功能的天然组织干细胞。

结果

为模拟肌肉硬度并将生物物理与生物化学效应分离，研究人员构建了一个可调的聚乙二醇（PEG）凝胶平台。通过改变前体溶液中PEG的百分比，产生具有一定硬度范围的水凝胶，包括模拟成体鼠骨骼肌弹性模量。传统上用于细胞培养的聚苯乙烯塑料板的弹性模量约3GPa，比骨骼肌硬5个数量级以上。层粘连蛋白（laminin）是天然MuSCs微环境的成分之一，与水凝胶网络共价交联并用作粘附配体。为确保层粘连蛋白密度及表面化学在水凝胶和塑料培养条件下保持一致，制作了聚合后不膨胀的凝胶，并在塑料表面浇筑一薄层PEG水凝胶（≤1mm），使MuSCs能够感知到下面塑料的硬度。

将MuSCs分离并以单细胞水平分析，柔软或坚硬的培养表面以微孔阵列图案化，因为即使以荧光激活细胞分选富集，干细胞群体也存在内在的异质性。使用微孔技术可实现延时获取数百个单一干细胞，但分析由此产生的大量数据集很有难度。因此研究人员开发了高度自动化的算法，称为Baxter算法(SOM)，它能跟踪多个细胞分裂的谱系关系。该算法将数据分析时间减少了约90%，错误率仅为1%。

通过延时采集和自动跟踪建立由单个细胞衍生的克隆谱系历史。与柔软（99mm/h）培养基质相比，在坚硬（120mm/h）基质上的MuSC速度增加，与已有研究结论一致。此外细胞面积随着细胞复制及其内容物的增加而增加，并在有丝分裂后回到初始细胞面积，进一步证明了分割参数的正确。

在柔软水凝胶基质上培养的MuSCs并不会经历先前培养中报道的“危机”或大量死亡。

培养1周后，软微孔中产生克隆的细胞数量是硬微孔中的2倍。通过Baxter算法可在克隆水平上描述这种现象。在坚硬基质上，总细胞数并不会随时间变化，因为分裂与细胞死亡相抵消；而在柔软基质上，细胞死亡减少，总细胞数随时间增加。两种情况下细胞都不会突然死亡，细胞死亡与时间和细胞分裂数无关。数据证明在软基质上培养可提高MuSC存活率。

（A）具有可调机械特性的PEG水凝胶。杨氏模量（E）与前体聚合物浓度呈线性相关；红圈为肌肉弹性。（B）绿色刮刀上的柔韧PEG水凝胶图像。水凝胶的共聚焦免疫荧光图像，以将层粘连蛋白微接触打印于水凝胶微孔底部。（C）流变仪分析胫骨前肌肌肉（n=5小鼠，共10个肌肉）。（D）不同硬度PEG水凝胶间，凝胶表面蛋白密度没有差异（E；P＞0.05），为7.6ng/cm2 ± 1.0ng/cm2（n＞4）。（E）Baxter算法分析延时视频。有数百个含单一MuSCs微孔的水凝胶阵列延迟显微成像3天。视频自动加工并分析。（F）单一MuSC（黑色点）在柔软或坚硬培养基质上的速度。圆圈表示均速 ± SD（P＜0.0001）。（G）延迟分析期间柔软（顶部）或坚硬（底部）基质上总MuSC数的变化。死亡（X）和分裂（O）。

基质硬度也会影响基因表达，暗示柔软表面上的MuSC的干细胞性得到保留。在柔软基质上培养1周的MuSCs，产生表达肌生成素（myogenin，分化的MuSCs表达的肌源性转录因子）的细胞，数量较培养于硬基质上的MuSCs多1/3。延时分析在MuSC开始分裂或分裂间都没有观察到统计学差异，因此排除了细胞分裂差异导致基因表达差异的可能性。另外，软硬基质间的分裂率也没有差异。表明基质硬度对培养中的细胞的分裂率没有影响，但可能会阻止分化并通过提高生存能力使细胞数量增加。

为证实柔韧基质上培养的MuSCs可保持干细胞性，体内评估了MuSCs的功能。从组成性表达萤火虫荧光素酶（Fluc）和绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠中分离MuSCs，培养7天。收获细胞并计数，培养的MuSCs子代移植到免疫缺陷小鼠的胫骨前肌（TA），该小鼠经18Gy腿部照射去除了内源MuSCs。通过无创体内生物发光成像（BLI）与细胞数相关的荧光素酶活性，定量分析供体细胞随时间的行为。将组织学检测到供体源肌纤维对应的生物发光值设置为植入阈值。这种体内功能分析对验证培养的MuSCs的干细胞性至关重要。

体内功能分析表明，培养于与肌肉组织生理模量想匹配的基质上的MuSCs可有效保持干细胞性。与之前的报告一致，塑料上培养的MuSCs植入减少。移植了培养于柔软水凝胶上MuSCs的小鼠，生物发光信号强，而移植了培养于坚硬基质上MuSCs的小鼠，植入程度和植入率都降低。与组织培养塑料相比，模拟骨骼肌弹性（12kPa）的培养基质是导致小鼠MuSC植入百分比有统计性增加的条件。

为确定具有植入潜力的培养细胞的比例，将MuSCs在柔软或坚硬基质上培养1周，随后稀释分析。移植了培养于坚硬塑料性基质干细胞的小鼠，均未显示出高于检测阈值的BLI信号。相比之下，当移植1000个以上水凝胶（12kPa）培养的干细胞时，植入发生率，与新分离的细胞类似。仅移植10个水凝胶培养细胞的小鼠中，有10%植入，与移植10个新分离细胞情况的水平（16%）相当。（A）体内移植实验方案。（B）受体小鼠移植100个GFP/Fluc MuSCs后1个月的BLI值散点图，MuSCs在不同硬度基质上培养7天（左；n=15）。移植了不同培养条件下细胞的小鼠的生物发光图像（右）。（C）高于植入阈值的BLI值实验条件的百分比。Fisher’s精确检验P＜0.05。（D）Fluc MuSCs在水凝胶（黑色）或塑料（红色）上培养7天，以不同数量移植1个月后，受体小鼠BLI值的散点图。移植了不同培养条件下细胞的小鼠的生物发光图像（右）。（E）各实验条件下呈BLI值在植入阈值以上的移植后小鼠的百分比。

体内移植时，培养于模拟肌肉组织的基质上的MuSCs展现出类似新分离MuSCs的动态增殖行为。两细胞群都经历了一个广泛的增殖时期，到达平台期并稳定，实现动态平衡。组织学鉴定GFP+肌纤维来源于再生，是由新分离或培养于柔软基质上的MuSCs再生获得。尽管新分离的与生长于柔软基质的MuSCs得到的植入率相当，但培养的MuSCs的植入范围并不如新分离细胞那样强劲，表明要体外培养可能还需要额外的生化因素，以涵盖实现体内大功能所需的其他关键微环境成分。培养于柔软基质的MuSCs一旦移植到肌肉中，可恢复到其天然的卫星细胞微环境，这是新分离MuSCs的典型特征。从表达LacZ（受Myf5启动子调控）的小鼠中分离MuSCs并培养于柔软水凝胶上，随后移植到小鼠中。收获组织前，用虎蛇毒素（notexin）破坏受体肌肉，使MuSCs激活并使肌源性转录因子Myf5表达上调。组织学分析β-半乳糖苷酶染色发现，与新分离细胞类似，在基底层之下和肌纤维之上的卫星细胞微环境中，也发现了表达Myf5的移植水凝胶培养细胞。

（A）通过BLI在移植后30天内监控新分离（黑线，方块；500细胞）、柔韧基质（绿线，圆；1500细胞）、坚硬基质（红线，菱形；1500细胞）上MuSCs的植入。（B）移植新分离（左；500移植细胞）或柔软水凝胶培养1周（右；2500移植细胞）的MuSCs1个月后，肌肉横切面免疫荧光检测GFP表达。GFP，绿色；层粘连蛋白，红色；Hoechst，蓝色。（C）免疫组化分析移植了培养于柔软基质MuSCs后1个月的横向肌肉组织。箭头所示为卫星细胞位置的供体源细胞。β-半乳糖苷酶,绿色；层粘连蛋白，红色；Hoechst，蓝色。

干细胞的典型特征之一是可通过分裂或自我更新获得更多拷贝。通过一些简明的体外方法已证实MuSC培养时会发生不对称和对称分裂，与自我更新一致。本研究用分离自Pax7-ZsGreen转基因小鼠的MuSCs，体外分析MuSC的基因表达，表明柔软的基质支持自我更新。观察到柔软微孔中，32%的doublets（单个细胞分裂产生的两个细胞）呈Pax7（MuSC标志物）阳性。相反，塑料微孔中只有6%的doublets阳性，表明柔软基质可使MuSC扩增。尽管基因表达数据很有提示性，但体内功能分析还是必需的，以确定培养中发生了自我更新分裂时间。

通过体内功能分析确定了干细胞发生了自我更新。以细胞群水平移植MuSC证实发生了植入，但并未表明培养中发生了自我更新分裂，因为细胞群中可能含有保持了干细胞特性的非分裂细胞。因此本实验将MuSCs铺于水凝胶微孔阵列中，并在铺种细胞后立即成像，在培养后2-3天成像以识别只含1个doublet的微孔。用显微操作器获取并汇集5个微孔中的doublets，共10个细胞，如此，每只小鼠移植10个细胞。可检测到BLI信号表明5个移植doublets中至少有1个发生了自我更新分裂，实现了植入。移植了培养于柔软基质doublets的小鼠中，有25%（3/12）可检测到植入，并且促进肌纤维再生，提供了体内功能性证据，即柔韧基质培养的MuSC发生了自我更新分裂事件。生长于坚硬塑料微孔上的doublets移植后从未展现出植入（0/14），表明其再生潜力迅速丧失。

即使多此分裂后，柔韧水凝胶上的MuSC也会自我更新。将分裂3-5次后的单细胞生长出的克隆移植到小鼠体内。结果发现移植了单克隆的小鼠有12%（1/8）展示出植入，证明柔韧基质上培养的MuSC即使多此分裂后依然保持自我更新。

图4 于柔软水凝胶培养可促进肌肉干细胞自我更新。

（A）体内自我更新分析方案。（B）柔软（n=47）或坚硬（n=32）微孔中，展现出Pax7+/+基因特征的doublets的百分比（右）。一个Pax7+/+ doublet的图像（左）。天然Pax7-ZsGreen，绿色；Hoechst，蓝色。（C）移植了柔软（n=12）基质或坚硬（n=14）微孔中doublets，或柔软微孔中克隆（n=8）的小鼠的生物发光值散点图（左）。生物发光值在阈值以下的小鼠图像（右）。（D）移植5个培养于柔软水凝胶上的MuSC doublets（顶部，GFP+纤维纵向约13mm）或单个克隆（底部，纤维纵向约7mm）1个月后，肌肉横切面免疫组化检测GFP表达。GFP，绿色；层粘连蛋白，红色；Hoechst，蓝色。

结论

本文探究了组织硬度（一种骨骼肌微环境的生物物理特性）对干细胞命运调节的影响力。通过用单细胞追踪算法以单细胞水平审视MuSC行为，证明了柔软基质可提高MuSC存活，防止分化并提升干细胞性。在小鼠中进行的功能性分析表明，柔韧基质允许培养中的MuSC自我更新。虽然潜在机制仍有待阐明，但可以假设硬度的减少改变了细胞形状，引发细胞骨架重排及信号通路改变，从而保持了干细胞性。尽管对单一参数，硬度，干细胞性可保留，但我们仍期望通过将额外的生化线索添加到平台中来进一步增强干细胞性。利用如本文所述的这种仿生培养平台进行的研究，可在促进体外增殖的同事保留干细胞性以及再生组织的能力，对干细胞研究具有广泛影响，也是发展细胞疗法的关键一步。