邻域效应影响植物叶际微生物群的种间变异

与植物叶片表面相关的微生物群落(即叶际微生物)在植物健康中的作用日益被人们重视。尽管越来越多的证据表明，宿主具有对其寄生微生物群的过滤作用，但人们对于叶际微生物群落组成是如何形成的（包括来自于邻域植物扩散的微生物群落）仍然所知甚少。本研究在为期三个月的田间试验中，对当地种植番茄、辣椒或大豆进行了以下实验。在实验中，宿主生长在有同种邻居或异种邻居(或没有邻居)的环境中。每隔30天，收获宿主植物并用新的年龄和物种匹配的植物进行替换，同时让附近的植物继续生长。基于16S rRNA 基因序列的微生物群落分析表明，宿主过滤效应的强度随着时间的推移而减弱。与此相反，邻域效应的强度随着时间的推移而增强，表明随着邻域植物生物量的增加，从邻域植物的微生物扩散对宿主叶际微生物变得更加重要。接下来，我们在温室内进行了交叉接种研究，利用田间植物产生的接种物在控制了微生物群落扩散来源和方向的前提下直接测试了宿主对微生物群落的过滤能力。该实验结果进一步证明了邻域效应会影响叶际微生物群落的来源。结果表明，微生物传播能力是叶层微生物群落组成的关键因素，邻域植物种类、生物量、年龄等因素是叶层微生物群落多样性的重要决定因素。    

结果

1. 不同邻域植物的田间实验处理 本研究首先比较了没有邻域植物、同种邻域植物和异种邻域植物种植的宿主的叶际微生物群。田间试验持续了3个月，每个月都用相同物种的植物替换宿主。经过处理后，216个田间宿主样本中的175个获得了高质量的测序序列(番茄n=63，辣椒n=52，大豆n=60)。在这175个中，64个来自收获时间点1，58个来自收获时间点12，53个来自收获时间点3。还有41个被排除的样本的reads都小于24，因此既不能扩增也不能产生序列。用于评估在移植到田间之前建立的宿主细菌群落的温室对照植物产生的reads非常少(45个样本中有28个的reads小于50)，这表明宿主移植前的细菌定植极少。宿主菌群以肠杆菌目、棒状杆菌目、伯克氏菌目和假单胞菌目为主。 现场试验数据集包含19,818个 ASVs,的5,414,393次观测值，其中13,455个出现>10次，2,253个出现>100次。在所有处理和宿主中，宿主内ASVs水平的丰富度为22-769ASVs。丰富度水平随采收时间的变化(F2,174=24.21,p<0.001)，在整个采收季节均呈下降趋势，并随宿主身份的变化而变化(F2,174=4.96,p<0.01)，其中大豆的丰富度较高，尤其是在第一次采收时。邻域植物域对细菌丰度无影响，但收获时邻域植物的总花数与邻域植物的细菌丰度呈正相关(R2adj=0.044,p=0.01)。除宿主株重和株高与多样性呈正相关(R2adj =0.022,p=0.03和R2adj=0.044,p<0.01)外，香农多样性的定性趋势相似。

单株细菌受不同宿主(F2,174=27.35,p<0.001)、相邻区域(F3,174=7.96,p<0.001)和收获时间点(F2,174=3.85,p=0.051)的影响，各变量间的交互作用均。番茄和大豆植物比辣椒具有更高的细菌丰度(p<0.001)。单株丰度与株重(R2adj=0.187,p<0.01)和株高(R2adj=0.117,p<0.01)呈正相关。如果将细菌丰度归一化，则发现宿主同一性(F2,174=3.24,p=0.041)和邻域效应(F3,174=2.17,p=0.094)较弱，而收获时间点效应较强(F2,174=5.15,p=0.024)。邻域生物量(R2adj=0.146,p<0.001)、平均高度(R2adj =0.123,p<0.001)、花总数(R2adj=0.022,p=0.038)与宿主细菌丰度呈负相关。每个宿主植物群落丰富度(R2adj=0.016,p=0.05)与Shannon多样性(R2adj=0.03,p<0.01)呈负相关。总的来说，叶际微生物群落以变形菌门、厚壁菌门和放线菌门为主。丰富的细菌目是芽孢杆菌目、伯克氏菌目、肠杆菌目、乳酸杆菌目、微球菌目、根瘤菌目、鞘单胞菌目和黄单胞菌目。聚类分析样本之间的差异受收获时间(R2=0.063,p=0.003),寄主物种(R2=0.055,p=0.003)、邻居植物(R2 = 0.023, p = 0.048)，相邻区域(R2=0.023,p=0.048)影响，宿主植物与收获时间点之间具有的相互作用(R2=0.034,p=0.033)，邻域植物与收获时间点的作用呈相同趋势(R2=0.041,p=0.072)。

2. 宿主特性对细菌群落组成的影响随着时间的推移而减少，而邻域效应则随着时间的推移而增加，并随宿主特性的不同而变化

作者通过使用宿主物种（即番茄、辣椒或大豆）、邻域（即番茄、辣椒、大豆或没有邻居植物）和实验区域（1-6）作为自变量对叶际微生物群落组成进行了探讨。结果表明，宿主特性对叶际微生物群落的影响是的，但在三个时间点的大小不同（时间点1：Adj.R2=0.096,p<0.001；时间点2：Adj.R2=0.068,p<0.001；时间点3：Adj.R2=0.027,p<0.001，）。相比之下，邻域状态的影响没有统计学意义，但在三个时间点增加（时间点1：Adj.R2=0.001,p=0.242；时间点2：Adj.R2=0.017,p<0.01; 时间点3：Adj.R2=0.032,p<0.001，)。在收获时未观察到变量之间的相互作用。

变量包括:宿主物种(番茄、辣椒、或大豆), 邻域(番茄、辣椒、大豆，无邻域),和不同实验块(1到6)。R 2 值代表模型的拟合， R 2 值已根据样本数进行调整，以使值在不同收获时间点之间具有可比性。 通过排除“无邻域”变量对模型的影响，作者通过将邻域（即番茄、大豆或辣椒）视为自变量来测试邻域的影响。结果表明，在整个植物子集上，随着时间的推移，宿主效应减弱（时间点1：Adj.R 2= 0.114, p <0.001；时间点2：Adj.R 2 =0.050, p <0.001；时间点3：Adj.R 2 =0.024, p =0.007）和邻域效应增加（时间点1：Adj.R 2= 0.003, p =0.325；时间点2：Adj.R 2 =0.010, p =0.031；时间点3：Adj.R 2 =0.018, p =0.013)。并且仅在时间点3观察到的实验块效应（Adj.R 2 =0.032, p =0.013），表明上述效应趋势受到“无邻域”变量影响。 

为了进一步确认细菌群落的丰度值是否会影响上述结论，作者将每个样品中每个分类单元的相对丰度乘以每10μlDNA(用于测序文库制备的体积量)的16SrRNA拷贝数，得出每个分类单元的丰度(准丰度)的估计值。利用PERMANOVA程序对得出的数据进行建模，得到了与相对丰度数据相同的定性结果。然而，数据结果显示宿主与邻域植物的相互作用从收获时间点2(R 2 adj =0.008, p =0.002)到收获时间点3(R 2 adj =0.024, p =0.003)逐渐增加，表明邻域效应对宿主的影响取决于宿主的物种身份，而且这种影响随着时间的推移变得更强。因此为了进一步评估不同宿主植物对邻域效应的敏感性是否存在差异，作者将数据按植物种类进行分类，并在3个时间点上分别评估邻域效应的强度。

结果表明，在时间点1，没有植物表现出可检测到的邻域效应。番茄作为宿主时在时间点3时仅表现出可检测到的邻域效应(R 2 adj =0.086, p =0.009)，而在任何收获时均没有阻断效应。辣椒作为宿主时，在时间点2时仅存在邻域效应(R 2 adj =0.108, p =0.013)。大豆作为宿主时邻域效应仅在时间点3时才出现(R 2 adj =0.069, p =0.012)。 

3. 邻域物种不同会减少宿主物种对叶际微生物群落的影响

为了验证有邻域植物的宿主比没有邻域植物的宿主具有更高的宿主间扩散率这一假设，作者对以邻域植物状态区分的宿主进行了模型选择。对邻域矩阵分析的主坐标生成的空间变量重复此过程，然后进行变异划分，划分出宿主因子对叶际微生物群落多样性的独特贡献。结果表明，在时间点2和3中找到了支持上述推断的证据证据，但没有在时间点1中找到，表明了宿主间扩散率依赖于邻域植物的年龄结构。对于时间点2和3，没有邻域植物对宿主的影响要强于有番茄、辣椒或大豆作为邻域植物的植株。在收获时，有邻域植物的宿主比没有邻域植物的对照组具有更高的宿主物种识别效应，这对于有番茄或大豆作为邻域植物的宿主来说尤其如此。然而，在辣椒周围的宿主中，宿主物种效应遵循一个峰状关系(先增加后减少)，而在番茄或大豆周围的植物中观察到的结果则是单调减少。这样看来，随着邻域植物生物量的增加，宿主叶际微生物群落更多地受到来自邻域植物的影响。

4. 宿主物种和时间不同影响系统发育聚类和中性模型拟合

为了更好地理解形成叶际微生物群落成员过程中的优势，并确定这三种植物是否可能受到不同装配过程的影响，作者对系统发育聚类模式进行了测试。宿主物种系统发育聚集的证据表明，系统发育的性状是以宿主特有的方式被选择的。并进一步使用每个样本中细菌ASV的平均成对距离(MPD)的标准化效应量(SES)来检验这一想法。结果表明，MPD SES受宿主物种(F2,175=219.86,p＜0.001)、收获时间点(F2,175=12.33,p＜0.001)、寄主收获互作(F4,175=43.84,p＜0.001)和邻域植物(F3,175=3.38,p＜0.05)的影响。番茄和辣椒相关的群落在三个时间点系统发育上的聚集性比预测的要高(如负的SES值所示)。相比之下，大豆相关群落则表现出系统发育过度分散的迹象。大豆的SES值随着时间的推移呈下降趋势，而且变化很大。一个例外是在收获3时，没有邻域植物的大豆在MPD SES中具有高变异性，具有同种邻域植物的大豆在系统发育上聚类，而具有番茄作为邻域植物的豆类聚类过度分散（Tukey HSD检测显示同种邻域植物和番茄邻域植物p=0.02）。

SES=(MPDob–MPDnull)/SD(MPDnull)，其中低于0的值表明系统发育聚类。B)中性模型的拟合随着时间的推移而下降，但因宿主身份而有很大差异。番茄（红色实线）、辣椒（绿色点划线）和大豆（蓝色虚线）在每次收获（x轴）中的中性模型拟合优度值（R 2 ，y轴）。实心圆圈表示统计中具有性，而空心圆圈表示统计上不的影响（负值或0拟合值）。 作者进一步拟合了一个中立模型，在这个模型中，被动扩散和生态漂移是建立叶际微生物群落的主要驱动因素，并统计对这个模型的拟合是否随着时间的推移而改变。结果表明，在三种宿主中，大豆相关群落的拟合优度高，其次是番茄相关群落，表明宿主之间在形成群落结构中的作用存在差异(图5B)。在时间点1和2，大豆和番茄的中性模型拟合均呈下降趋势(大豆:收获1 R 2 =0.483，收获2 R 2 =0.074;番茄:收获1 R 2 =0.214, 收获1 R 2 =0.052)，时间点3上，中性模型没有对两组植株进行拟合(显示为负拟合优度值)。在这三个时间点上，辣椒宿主均未被中性模型拟合(显示为负拟合优度值)。 

5. 温室实验揭示接种源不同对叶际微生物群落的影响 

为进一步研究叶际微生物群落在宿主间传播所受到的影响，作者随后进行了温室中的研究。从田间回收的叶际微生物群落被移植到收集它们的相同植物物种上，或移植到原植物周围的植物物种上。在总共105个这样的相互接种中，103个样本产生了足够的高质量序列进行分析。结果数据集包含1734个序列的2,640,588个观测值，其中1379个出现超过10次，其中621个出现超过100次。 结果表明，样品的序列丰度与温室样品中可检测到的接种物序列数量呈线性关系(R 2 adj =0.105, p =0.004)。接种物和实验植物之间重叠序列的数量与宿主物种同一性  (F 2,88 =8.503, p ＜0.001)，接种物取样的前一个寄主物种(F 2,88 =3.871, p ＜0.001)，寄主与前一个寄主之间(F 4,88 =2.598, p =0.03)，寄主和前一个邻域物种之间的相互作用相关(F 4,88 =2.968, p =0.03)。与野外研究相似，叶际微生物群落以变形菌门和厚壁菌门为主。丰富的细菌目为芽孢杆菌目、伯克氏菌目、肠杆菌目和假单胞菌目。处理植物上的细菌群落结构与仅应用无菌缓冲液的对照植物不同(PERMANOVA R 2 =0.056, p =0.048)。进一步使用热灭活的接种物作为对照进行试验。

结果表明，接受热灭活接种的植物与接受活接种物的植物相比，其与宿主物种的差异性更小。根据实验植物是否接受来自异种（不同物种）或同种（相同物种）宿主的接种物对样本进行子集化，结果表明异种移植比同种移植产生更多可区分的宿主（Adj.R 2 =0.123, p <0.001 vs Adj.R 2 =0.109, , p <0.001）。因此，接受活接种物的处理植物更有效地推动了叶际微生物的分化，并且异种特异性接种源进一步促进了叶际微生物分化。 作者通过指示物种分析确认了在田间试验(时间点2)和温室试验中在三种宿主物种上富集的微生物群落。在田间可用来区分辣椒宿主的34个微生物群落中，有6个是在温室数据集中发现的，这些微生物群落的集体相对丰度在温室中的辣椒植物上显着高于番茄（ Tukey HSD p ＜0.001））或豆类（ Tukey HSD p ＜0.001）。温室中发现了25个区分番茄的分类群，并且番茄（ Tukey HSD p ＜0.05）和辣椒（ Tukey HSD p ＜0.01）植物上这些类群的总体相对丰度高于豆类。温室中发现了27个区分豆类的分类群，但它们的相对丰度在宿主之间没有差异（ p >0.05）。 

6. 温室实验揭示接种源不同对叶际微生物群落的影响

宿主中序列水平的丰度范围为24~231个序列，且受宿主物种身份(F2,74=12.41, p＜0.001)、宿主与原宿主身份之间的交互作用(F4,74=3.50, p＜0.05)和实验群落影响(F4,74=2.43, p=0.058)。3种植物中，辣椒的丰富度高于番茄和大豆(p<0.001)，但两者之间差异不(p>0.05)。当接种为同源转移(即在同一种植物的两个植株之间移动)时，供体植株生物量和受体植株丰富度之间呈负相关但弱相关(Adj.R2=0.09,p<0.05)。然而，当接种为异种转移(即在两种不同的植物物种之间)时，供体植物生物量和受体植物丰富度之间存在强的正相关关系(Adj.R2=0.21,p<0.01)。在同种移植物与异种移植物间丰度差异无统计学意义(p>0.05)。

7. 叶际微生物群落移植实验揭示了不同宿主物种以及供体植物邻域植物的影响

基于Bray Curtis差异的研究表明，不同宿主物种(R2=0.127, p<0.001)、先前的宿主物种(即接种物的来源) (R2=0.468, p<0.001)和实验块(R2=0.156, p<0.001)均对实验温室植物的叶际群落结构差异有影响。此外，我们还观察了供体植物生物量对受体植物叶际群落结构的影响((R2=0.018,p=0.05)。温室辣椒的叶层群落结构存在“祖父母效应”。也就是说，辣椒叶际群落强烈地受到前宿主的邻居的影响(R2=0.194,p<0.001)。辣椒叶际群落结构与先前宿主的物种身份也存在一定的相关性(R2=0.107,p=0.061)。与在辣椒上观察到的结果相反，在番茄或大豆亚群上既没有观察到先前的邻居效应，也没有观察到先前的宿主效应。