慢阻肺疾病气道宿主-微生物相互作用的多组学分析确定了潜在的治疗干预措施

气道微生物组在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的作用机制在很大程度上仍未被探索。本研究通过对我国99名COPD患者和36名健康个体的痰液宏基因组、代谢组、宿主转录组和蛋白质组进行深入分析，展示了COPD中气道微生物组-宿主相互作用的概况。

通过序列中介效应分析整合多组学数据，以评估微生物组与两种主要COPD炎症内型(嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞炎症)的相关性。

利用微生物遗传信息和建立的代谢物-人类基因对确定了“微生物组-代谢物-宿主”相互作用的假设。中性粒细胞为主的COPD的一个重要假设是气道乳杆菌中色氨酸代谢的改变与吲哚-3-乙酸(IAA)的减少相关，这反过来又与受干扰的宿主白细胞介素-22(IL-22)信号传导和上皮细胞凋亡途径有关。

体内和体外研究表明，气道微生物衍生的IAA通过IL-22介导的巨噬细胞-上皮细胞相互作用减轻中性粒细胞炎症、细胞凋亡、肺气肿和肺功能下降。鼻内接种两种气道乳杆菌可恢复IAA并重现其对小鼠的保护作用。这些研究结果为靶向COPD中微生物-宿主相互作用的治疗手段提供了理论依据。

结果

COPD痰液宏基因组

本研究收集了广州与深圳两地共99例慢阻肺患者和36例健康对照的诱导痰进行多组学分析。宏基因组测序平均每个样本产生1.83×108个高质量reads。去除宿主reads后，平均保留1.53×107个微生物reads(保留reads的比例:1.8-71.8%)，从组装的重叠群中产生2,901,665个非冗余微生物基因。

其中，1,722,043个基因(59.3%)被注释到6678个KOs。随着样本量的增加，基因和KO水平的稀疏曲线都接近平台期，表明有足够的宏基因组覆盖(补充图1a)。在发现和验证数据集中，COPD患者与分类和功能特征对照之间存在部分但的差异(图1a)。位点与所有个体以及COPD患者和对照组的分类学和功能特征相关(分类学：R2=0.038，P=0.017；宏基因组：R2=0.047，P=0.017)。

来自基于reads的分类学中的31个物种在COPD和对照组之间差异丰富(错误发现率(FDR)<0.1)。Moraxella catarrhalis和Pseudomonas aeruginosa的相对丰度在COPD中增加多，而Prevotella intermedia在COPD中减少多。在这31个物种中，有20个与COPD在两个部位具有相同的方向性。qPCR结果显示COPD中细菌总量与对照组相比无明显下降。

为了便于解释COPD相关的微生物功能，我们将KO水平的关联聚集到KEGG模块中，通过使用Wilcoxon秩和检验将每个模块中与COPD相关的所有KO水平与模块外(背景)其余KO的水平进行比较。对于这些模块，为每个样本计算代表模块富集程度的分数，从而产生维度降低的模块级宏基因组图谱(me[x]taG模块)。KEGG富集分析发现细菌转运系统和氨基酸生物合成模块在COPD患者中普遍富集，而减少的模块包括能量代谢和氨基酸代谢。

不同的模块组与痰中性粒细胞或嗜酸性粒细胞百分比相关，表明内型特异性宏基因组特征。没有分类群或功能模块与吸烟状况或吸入皮质类固醇(ICS)的使用相关。为了在基因组水平上探索微生物组的变化，我们通过基于基因组特征的重叠群分箱来重建宏基因组物种(MGS)。

在总共产生的1,273个基因组分箱中(占所有重叠群序列的43.7%)，根据“MIMAG”标准，分别有384和82个符合中等和高质量标准，其中384个bins包括66个种及40属，涵盖所有主要门，占总系统发育多样性(Faith’s系统发育多样性)的37.4%。COPD患者与对照组相比，MGS衍生物种的差异趋势与基于reads的分类法得出的差异趋势基本一致。

总体而言，这些结果表明COPD患者的气道宏基因组发生了变化，其特点是氨基酸的合成代谢途径相对于分解代谢途径的比例增加。

采用Ward方法对模块和样本进行双向层次聚类。模块的树状图没有显示。与肺活量(FEV1)和痰液差异细胞计数(NEU，中性粒细胞；EOS，嗜酸粒细胞；Mφ，巨噬细胞)的模块水平Spearman相关性，以及模块的功能类别显示在热图旁边。CckA，细胞周期组氨酸激酶A；ChpA，pil-chp组氨酸激酶A；ChpB，pil-chp组氨酸激酶B；CpdR，双组分受体蛋白CpdR；CtrA，细胞周期转录调节因子A；EHEC，肠出血性大肠杆菌；EPEC，肠致病性大肠杆菌；PleC，多效发育基因C；PleD，多效发育基因D；PTS，磷酸转移酶系统；RpaAB，双组分反应调节器RpaAB；SasA，聚球藻自适应传感器A；tRNA，转移核糖核酸。

d. Cladogram图显示COPD患者与对照组相比，384个MGS满足中等及以上质量，其完整性、污染和倍数变化。

COPD痰代谢组、宿主转录组和蛋白质组

非靶向痰代谢组学产生了1,671种已知的代谢物。在COPD患者和健康个体之间观察到了部分但的分离。

通过加权相关网络分析(WGCNA，me[x]taB模块)，将所有代谢物分为128个共丰度模块。分别有37个和24个模块在COPD中富集或减少。37个COPD富集模块包含475种代谢物，其中35.6%是氨基酸、碳水化合物和类固醇。COPD中的氨基酸积累与其宏基因组中代谢的改变一致。

24个COPD减少的模块包括275种代谢物，其中89个是磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺，这一结果也与COPD宏基因组中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺(P00564)的分解代谢增加相一致。

包含氨基酸、脂质和胆汁酸的61个模块中有38个与痰中性粒细胞相关，而16个模块主要包含与嗜酸性粒细胞相关的磷脂酰胆碱

对于宿主转录组，所有19,142个人类基因被分成497个共丰度模块(宿主转录组(HostT)模块)。

其中，126个模块在COPD患者和对照组之间差异表达，并且可以富集到经典途径(图2c所示的前十个模块；补充表6，FDR<0.05)。高的差异模块与上皮细胞凋亡、气道平滑肌收缩、hedgehog信号传导和中性粒细胞细胞因子的产生有关。大多数差异模块(88.9%)与嗜中性粒细胞相关，而与嗜酸性粒细胞趋化性、嗜酸性粒细胞蛋白释放和肥大细胞迁移相关的14个模块(11.1%)与嗜酸性粒细胞相关。卷积分析表明转录组差异是细胞组成差异和细胞内基因表达变化的结果。

宿主蛋白质组的分析确定了60种痰液和38种血清蛋白质(宿主蛋白质组(HostP))在COPD患者和对照组之间差异表达。虽然有个别模块与吸烟或ICS相关，但整体的代谢组和宿主多组学特征与吸烟或ICS没有明显关联(补充图3和补充表5-7)。

总的来说，共同改变的微生物组、代谢组和宿主活动表明COPD中微生物-宿主的相互作用受到干扰。降维得到了113个me[x]tagome(me[x]taG)、61个代谢组(me[x]tab)、126个HostT模块和98个HostP特征与COPD相关，确保了有足够的统计能力进行综合分析。

对于每种类型的组学数据，都有一组病情较轻的COPD患者与健康对照组相比显示出有限的差异，这表明COPD的多组学变化特别是由疾病严重程度增加的患者驱动的。

a.主成分分析表明，COPD患者和健康对照组的代谢组、宿主转录组以及痰和血清蛋白质组之间存在部分但的分离。

痰和血清蛋白质组只针对发现数据集中的一部分个体进行了表征。b.痰代谢组的共丰度模块。

为便于展示，显示了COPD患者和健康对照组之间的前十个差异模块。代谢物与肺活量(FEV1)和痰液差异细胞数(NEU、EOS、Mφ)的关联，以及代谢物的功能类别显示在热图旁边。c.宿主转录组的共丰度模块。只显示了COPD患者和健康对照之间的前十个差异模块。

基因水平与肺活量(FEV1)和痰液差异细胞数(NEU、EOS、Mφ)的关联，以及该基因在富集程度高的通路中是否存在，都显示在热图旁边。d. COPD患者与健康对照组痰蛋白和血清蛋白的差异。AXL，AXL受体酪氨酸激酶；BCMA，肿瘤坏死因子受体超家族成员17；FGF-19，成纤维细胞生长因子19；GRO，生长调节α蛋白；HGF，肝细胞生长因子；ICAM-3，细胞间黏附分子3；LIF，白血病抑制因子；MCP-3，单核细胞趋化蛋白3；MDC，巨噬细胞衍生趋化因子；sRAGE，可溶性晚期糖基化终末产物受体；Tie-2，酪氨酸蛋白激酶受体TIE-2；VEGFR1，血管内皮生长因子受体1