心脏代谢健康、饮食和肠道微生物组: 宏组学视角

心脏代谢疾病(CMDs) ，包括糖尿病、胰岛素抵抗、心脏病发作、中风和非酒精性脂肪肝，在老龄化社会中呈上升趋势，是西方国家发病和死亡的主要原因。目前，有几个的与CMD相关的遗传和环境风险因素：吸烟、腹部肥胖、胰岛素抵抗、高血压、高胆固醇和不健康饮食。此外，人类微生物组的组成与CMD的发展和进展之间的联系正受到关注。由于通过饮食和治疗干预可以改变肠道微生物组，因此了解促进或抑制从健康状态转变为CMD的潜在饮食和微生物因素之间的相互作用，为预防和治疗开辟了新的途径。 然而，由于个体饮食、肠道微生物群和心脏代谢表型之间的关系具有多向性、多因素性和复杂性的特点，因此很难理解(图1a)。因此，将已有知识转化为实施靶向微生物依赖的调节策略(如个性化饮食指南)并非易事，而是需要对心脏代谢健康(CMH)和疾病中的微生物和宿主有系统性的理解。对特定微生物、代谢产物或食物进行有针对性的、机制的、自下而上的研究有助于建立这样的系统级模型，但只有通过自上而下的、无靶向性的、无需培养的宏组学方法，才能重建全面动态图景。到目前为止，少数开创性研究已经开始鉴定潜在的CMH微生物标志物，并已建立了证据基础，为进一步的研究提供信息(表1)。

本篇综述总结了应用于微生物群落的非靶向、高通量基因组和分子方法(宏组学方法)，并讨论了它们在解开CMD中人类微生物组、宿主代谢和饮食之间复杂的相互作用方面的潜力。作者重点关注近期的大规模研究，以更好地理解饮食-微生物-代谢组轴和CMH之间的相互作用。作者讨论了如何将这些研究结果整合到旨在降低CMDs风险和严重程度的精营养策略中。

2宏组学解开CMD中饮食-微生物组-代谢组轴

研究迅速加速了我们对人类微生物组在CMD中的作用的理解。新方法已经从简单地分析微生物组的分类组成，扩展到在单个基因组层面表征微生物组组成。此外，研究也在关注微生物基因表达情况和这些微生物产生的代谢物。

2.1宏基因组和宏转录组

鸟枪宏基因组学是指对微生物群落(通常包括细菌、古菌、病毒和微型真核生物)的DNA进行高通量测序。测序结果可以分析样品的分类组成(即微生物分类群的存在情况及其相对丰度)及其功能代谢潜力(这些功能涵盖抗生素耐药谱、毒力因子、编码分解特定营养化合物的酶的基因)，以及鉴定已知和未知的微生物。基于扩增子的16S核糖体RNA(16S rRNA)基因测序，是指用PCR扩增16S核糖体高变区，然后进行测序。这是一种比宏基因组学更具成本效益的技术，但只能检测细菌和古细菌，并且分类分辨率有限。此外，由于它没有考虑16S rRNA基因以外的基因，因此不能提供微生物组功能潜力的信息，而只能预测。因此，虽然16S rRNA基因测序已用于许多开创性的微生物组CMD研究，但随着测序成本的不断降低，它正在被用于人类微生物组研究的鸟枪宏基因组学所取代。 宏转录组学对微生物群落表达的RNA转录本库进行高通量测序。宏转录组学提供微生物基因表达水平信息，可以发现活跃表达的基因功能，并在纵向研究设计中使用时，能够监测微生物基因表达随时间的变化情况。与宏基因组分析相比，宏转录组学仍然存在重大的技术挑战(例如，保持RNA完整性和富集信使RNA)，但它在该领域的重要性越来越强。

2.2宏蛋白组和代谢组

宏蛋白质组学和代谢组学方法通过直接测定产生的蛋白质和其他分子来进一步分析微生物组的分子级联反应。宏蛋白质组学可以大规模测定给定样本中微生物群落编码的功能产物(整个蛋白质库)，揭示正在进行的代谢过程。宏蛋白质组学使用高分辨率质谱，或可选结合液相色谱法，分离并鉴定肽混合物。当获得肽序列后，可以与基因组数据库相结合，将蛋白质与编码它们的微生物联系起来。虽然目前只有一小部分蛋白质物质被可靠地鉴定出来，并且由宿主和微生物物质的混合物组成，但标准化流程和编目工作正在增加其在宏组学研究中的应用。 代谢组学针对微生物群落、宿主以及微生物和宿主结合通路产生的低分子量分子(代谢物)，提供总体代谢状态和相互作用的信息。由于分子大小、极性和丰度的多样性，整个代谢物库的鉴定和定量仍然具有挑战性。使用不同的技术，代谢组学方法既可以测量确定的特征小代谢物集(靶向代谢组学)，也可以对代谢组进行更具探索性和更全面的分析(非靶向代谢组学)。前者具有更高的灵敏度，可以实现(半)定量(使用内标和跨批次标准化)，并且可以通过使用特定的样品制备方案来减少偏差，这取决于感兴趣的代谢物阵列。相比之下，非靶向代谢组学方法具有检测大量代谢物和尚未表征的代谢物的优势，这些代谢物难以分析，但能够对研究CMH相关通路提供新的思路。此外，也可以结合非靶向和靶向代谢组学，利用这两种方法的优势。虽然处理和解释高通量代谢组学的结果仍然具有挑战性，但代谢组学提供了宿主生理状态和宿主-微生物组相互作用层面的有效、直接的功能数据。

2.3单细胞基因组学和培养组学

单细胞基因组方法可以通过在测序前分选和靶向特定微生物来提供更高分辨率的宏组学数据，以达到单细胞分辨率。这使得研究微生物组的异质性和分析低丰度和未培养分类群成为可能。尽管分类的偏倚阻碍了精确的定量估计，但这项技术对于揭示物种和菌株内微生物的多样性具有很大的希望。 培养人类微生物组仍然具有挑战性，但从环境样品中高通量分离和培养微生物分类群的新方法正在迅速发展。而且，组学技术可以应用于单个菌落，以补充宏组学的发现，其优势是高通量分离和培养方法(培养组学)允许以单个微生物组成分作为体外或体内实验和转化的一部分进行进一步表征，培养整个微生物群的尝试也在进行中。在这样的系统中，微生物群接种量达到了类似于群落原始组成的生态平衡，并且更便于用宏组学方法进行研究，也可以响应明确的外部刺激。

2.4病毒组测序技术

宏组学技术也可以用于分析病毒组组成，已有研究证明在饮食干预后病毒组发生改变，与微生物组中细菌变化类似。噬菌体(只感染细菌的病毒)甚至比细菌更丰富，可以极大地改变目标细菌宿主的种群和整个微生物群的生态。因此，如果在适当的实验环境中进行病毒组研究，通过噬菌体调节微生物组的特定成分，可以为靶向治疗干预开辟新的可能性，其优点是可以避免广谱药物的副作用和抗生素耐药性的传播。

2.5其他方法和技术

尽管不是本综述的重点，但CMD的动物模型已经建立并被广泛采用。宏组学可以应用于这些微生物组，在收集、存储和处理偏差方面的挑战更少。因此，宏组学方法通用性很强，可以应用于具有基本相同方法原理的广泛场景；然而，独立于应用领域之外，仍然具有挑战性的是它们产生的不同信息层的集成和解释。随着所有宏组学的不断改进和可用性的增加，我们认为它们的整合是目前阐明微生物组-宿主-饮食相互作用的主要障碍。

3大规模CMD宏组学研究

考虑到人类微生物组固有的个体间差异(包括种群内和种群间)以及组学数据的高维性，宏组学研究必然需要大样本量和相对复杂的研究设计。因此，到目前为止，只有少数研究能够提供对微生物组-饮食-宿主相互作用的初步系统级理解。这些研究大多使用了成熟的鸟枪宏基因组学方法(附表1)，但那些与代谢组学和其他技术相结合的研究(表1)展示了多组学方法的额外价值。 心脏代谢疾病的宏基因组学(me[x]taCardis)项目展示了大规模多元组学应用于CMD的潜力(表1)。该项目应用大规模宏基因组学和代谢组学(n=1241人)，比较了缺血性心脏病患者、代谢受损对照组(例如，糖尿病或肥胖症患者)和健康对照组的特征。肥胖和2型糖尿病患者以及有心脏病早期和晚期临床表现的患者出现多种微生物组、血清和尿代谢组改变。这些变化反映了不同的代谢通路，也与他们饮食的营养成分、整体能量摄入和生活方式有关。这表明，肠道微生物组和代谢组的巨大变化可能早在缺血性心脏病临床发病之前就开始了。

在另一项大规模研究中，对膳食成分的个性化反应试验(PREDICT 1)，对1102名受试者在禁食条件下和餐后多个时间点进行了宏基因组学与血液代谢组学联合分析。该研究还收集了短期和长期的饮食信息，以检测肠道微生物与特定营养素和食物组(尤其是植物性食物)之间的多种关联。此外，作者还鉴定了微生物粪便生物标志物，这些生物标志物可作为餐后血糖、血脂、炎症反应和肥胖的指标。与宏基因组学和代谢组学相比，到目前为止只有很少且相对小规模的宏组学研究使用了宏转录组学和宏蛋白质组学，以分析复杂的饮食-微生物-CMH相互作用。

可以说，它们还没有展示全部潜力，但随着它们的发展，可能会补充那些常用的宏组学技术。宏蛋白组的研究还很不充分，但大规模的研究迅速提高了我们对微生物“暗物质“组成的认识。 将这些和其他宏组学与宿主组学结合起来，以深入了解宿主-微生物组的关系及其与CMD的联系也很重要。整合微生物组学和宿主组学的研究之一是人类微生物组计划(HMP2)的第二阶段，该计划将宏基因组学和代谢组学与宿主转录组学和蛋白质组学相结合。在其中一项HMP2研究中，对106名健康个体和糖尿病前期个体的肠道和鼻腔微生物组进行了为期4年的纵向采样，以评估宿主-微生物群动态变化并识别胰岛素抵抗的特征。通过整合典型途径分析进行的多组学数据整合显示，病毒感染后，健康参与者的宿主免疫系统和微生物组组成发生了协调变化，而糖尿病前期患者暴露于病毒后，免疫反应受损，微生物组在分类和功能水平上发生了改变。

在另一项涉及炎症性肠病(IBD)患者的HMP2研究中，综合宏组学分析(包括宏转录组学、宏蛋白质组学和代谢组学以及宏基因组学)用于在功能水平上识别IBD期间生态失调的特征，这也可以应用于CMD患者。其他新兴的宏组学，如表观基因组学(分析微生物群落中的DNA甲基化模式；例如，使用单分子实时和循环一致性测序技术)也可以在未来用于补充常用的宏组学方法。

4饮食和肠道微生物组成之间的密切联系

饮食是CMH的一个重要决定因素，但它也比宿主基因更能塑造肠道微生物群的组成和特征。肠道微生物表现出特定的营养偏好性。一些细菌种类(主要是厚壁菌门)可以利用肠道中多种主要营养物质(即多糖、蛋白质和脂类)，而其他许多细菌则专门利用特定的营养物质。双歧杆菌(Bifidobacterium，放线菌门)主要是糖分解菌(这意味着它们主要代谢碳水化合物)，而另枝菌属(Alistipes)细菌主要代谢蛋白质，普雷沃氏菌(Prevotella)主要代谢复合碳水化合物和植物纤维。从长期来看，饮食习惯会影响微生物组，但短期饮食干预也能迅速改变微生物组的组成。David等人连续5天为10名研究参与者提供植物性或动物性饮食，然后评估了微生物组的分类组成(宏基因组学)和基因表达(宏转录组学)。动物性饮食模式降低了代谢植物多糖的微生物物种的丰度，同时增加了耐胆汁细菌的丰度，这一特征反映在宏转录组数据上，显示了碳水化合物和蛋白质代谢之间的平衡。另一项研究对34个人进行了为期17天的每日粪便采样、宏基因组学和24小时食物记录，发现饮食多样性与微生物组的稳定性有关。 宏组学技术正在迅速提高我们捕捉此类干预措施影响的能力，但由于数据的高维性，这些数据需要密集的纵向抽样和大样本量，而现在这些研究才刚起步。此外，由于收集和分析食物频率问卷和营养日记中的信息并不简单，因此有必要改进个人饮食分析方法。在解决了这些问题后，饮食干预似乎是一种很有前景的治疗策略，可以调节微生物组，使其朝着与降低CMD风险相关的更有利的方向发展。

4.1饮食干预研究中的宏组学

地中海饮食(也称为MedDiet)的特点是植物性、加工程度低的食品摄入高，而动物源性、高度加工的食品摄入量少。已有纵向观察和干预研究探究了地中海饮食对肠道微生物组组成的积极影响。一个长期观察性卫生专业人员随访研究的子研究，在6个月内分析了925个宏基因组和340个宏转录组。在这项研究中，MedDiet指数(衡量饮食依从性)在微生物组组成的变化中占第三(仅次于甘油三酯水平和质子泵抑制剂的使用)，因此甚至比抗生素的使用更重要。较高的MedDiet依从性与肠道微生物组中短链脂肪酸(SCFA)产生菌的丰度呈正相关。相反，较低的MedDiet依从性与次级胆汁酸生物合成潜力的升高有关。MedDiet与心脏代谢风险之间的保护性关联在肠道菌群缺乏Prevotella copri的参与者中明显更强。有趣的是，与工业化和城市化程度较低的社会相比，在典型西化生活方式的社会中P. copri的流行率降低，这可能是由于复合植物纤维的饮食摄入量不同。P. copri还可以调节葡萄糖代谢的改善，并与空腹和餐后心脏代谢和炎症标志物(如内脏脂肪、极低密度脂蛋白胆固醇和GlycA)呈负相关。P. copri仍然是一种了解不足的细菌，其物种多样性不断扩大，在健康方面发挥着环境依赖性作用，并且是一个明确的例子，表明单一物种的存在不足以驱动与宿主健康和饮食的强烈关联，因此应该研究微生物组的完整多类群潜力。 几项干预性研究证实了MedDiet的有益作用及其与微生物组的关系。Meslier及其同事在一项随机对照试验中招募了健康超重和肥胖参与者，发现与对照组(常规饮食)相比，MedDiet组的Faecalibacterium prausnitzii和罗氏菌属(Roseburia)物种的丰度增加，而Ruminococcus gnavus和Ruminococcus torques的丰度较低。作者发现胰岛素抵抗的改善与特定的细菌有关，包括P. copri相对丰度较低以及基线时单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)和普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)丰度增加。因此，越来越多的证据支持富含纤维的饮食(如MedDiet)通过肠道微生物群的可重复变化对CMH产生有益影响。其他已被探索用于改善CMH的饮食包括限时饮食(即间歇性禁食)和生酮饮食(减少碳水化合物摄入)，但它们对微生物组的积极影响尚不清楚。随着对饮食-微生物组-CMH联系的了解程度逐渐升高，可能有助于设计更具体的饮食方案来调节微生物组，使其朝着促进CMH的佳组合方向发展。

5饮食-宿主-微生物组相互作用导致的代谢物“交易”

除了影响微生物组的组成外，高度复杂的人类饮食(包含数千种迄今尚未表征的膳食化合物)在被宿主消化和微生物代谢时还导致复杂的分子“交易”。代谢物是高度动态的，因此可以为诊断、预后和监测治疗效果提供信息。鉴于代谢组学方法通常只能识别具有可接受置信度范围内的有限部分代谢物，因此准确区分CMH中重要的不同类型代谢物至关重要。这些不同类型的代谢物(图2)包括膳食代谢物、由膳食底物或宿主衍生化合物产生的大量微生物来源代谢物、药物化合物和微生物组修饰药物，以及宿主代谢物(尽管宿主代谢物不是本文的重点)。因此，通过代谢组学检测到的代谢物通常是由摄入饮食和药物产生的分子、身体产生的代谢物、微生物途径产生的代谢物以及宿主和菌群都可以产生的代谢物的混合物。根据样品的性质，这些大类代谢物以不同的比例存在。事实上，由于代谢组学可以在多种生物样本上进行(包括尿液、血液、粪便和唾液)，因此追踪各器官的代谢物对于揭示系统机制非常重要。

(1)膳食代谢产物被宿主和/或其微生物组消化。

(2)微生物组的成员从膳食底物或宿主产生的其他代谢物中产生一个代谢物池。

(3)药物化合物也可以被微生物组改变(例如，灭活或生物积累)。

(4)代谢组学技术检测宿主产生的代谢物，以及微生物组产生的代谢物。所有类型的代谢物都会影响CMH状态。

5.1膳食化合物

饮食是各种化合物的主要来源，例如咖啡等简单的食物含有数千种不同的分子，其中许多未知的或依赖于特定类型的咖啡或制备方法。虽然讨论膳食化合物的多样性是一份艰巨的任务，并且超出了本综述的范围，但有一类因其对CMH的潜在益处而受到广泛研究的膳食代谢物是多酚。这是由数千种分子(酚酸、类黄酮、木脂素、木质素、香豆素和二苯乙烯)组成的复杂分子群，存在于浆果、蔬菜、茶、咖啡、葡萄酒、可可、橄榄油、坚果和种子中，是植物的防御化学物质。现有的靶向代谢组学可以检测到许多多酚，并发现它们与降低微生物介导的心脏代谢风险有关。据估计，只有10%的膳食多酚在小肠中被代谢和吸收，而其余的多酚则进入结肠，在结肠中被肠道微生物代谢。与此相一致的是，多酚的摄入与特定类群的相对丰度和微生物组多样性的增加有关。 共轭亚油酸(CLAs)是另一组膳食来源的代谢物(主要存在于反刍动物的肉类和乳制品中)