纳米抗体融合标签对比研究

目前关于不同融合标签对重组抗体特性影响的评估鲜有报道，因此难以选择合适的标签。本期小编分享一项研究工作，该研究比较了不同标签对相同纳米抗体的生物物理特性的影响。

纳米抗体融合标签

该研究评估的标签融合抗体均含有双重融合标签。所有标签融合抗体都有6xHis标签，可通过IMAC实现亲和纯化。第二个标签则可以提供荧光（例如EGFP），也可以用于位点特异性修饰（例如Sortase标签、Avi标签、自由半胱氨酸等），还可以通过自催化修饰酶（SNAP、CLIP和HALO等）与各种商业化学品发生衍生化。这种多样性使得抗体更具活性，更易于应用于不同领域。

将编码特定抗HER2 VHH（A10）的序列插入一组用于表达不同C末端双标签构建物的载体中。所有构建物均在存在重组硫氧化酶的情况下在大肠杆菌细胞质中表达，并通过两步色谱（IMAC和离子交换色谱 - IEX）进行纯化。纯度超过90%，产量在2-10mg/L培养液的范围内。

不同标签对纳米抗体功能化后的性质影响

Avi标签

使用Avi标签实现纳米抗体功能化的简单方法是与酶BirA一起共同表达在同一宿主中。然而，在常规大肠杆菌中，这种方法效果不佳，因为抗体和BirA若在细胞质中共定位，抗体折叠会受到抑制；若在外膜中，BirA活性较低；若在不同的细胞亚结构中，细胞质生物素化时间太短。因此，在体内或体外反应时，效果更好。通常，通过IMAC纯化后，消除过量的游离生物素，然后使用链霉亲和素进行第二次亲和纯化。虽然步骤繁琐，但得到的生物素化的VHH-HisAvi构建物可以与链霉亲和素过氧化物酶有效结合，实现酶催化反应。

Sortase依赖的结合方法

这种方法要求纳米抗体具备合适的五肽LEPTG（Sortase）C末端标签，并且与具有N-末端多聚甘氨酸序列的配体进行结合。研究结果表明，使用Sortase A对纳米抗体进行功能化需要耗时的优化过程和大量的底物。与其他替代方法相比，功能化产率也较低。因此，研究人员不认为Sortase标签是一种适合的功能化方法，并且没有进行相应构建物的生物物理特性表征。

生物物理特性综合比较

本研究对纳米抗体功能化后的生物物理特性进行了综合比较，包括完整性、均一性、稳定性以及对抗原的亲和力。

在寡聚状态方面，除了Avi标签外所有构建物均为单体，Avi标签抗体显示出二聚化的倾向并形成不溶解的聚集物。

有报道当标签与目标蛋白的C末端融合时会出现断裂。研究者在实验中观察到在IMAC洗脱液中存在这样的副产物，但除了HALO外，在IEX（离子交换色谱）步骤中它们可以被有效去除，得到的纯化抗体在4°C和-20°C储存时可保持稳定。

在室温（21°C）下存放2周来评估纳米抗体与融合标签对稳定性的影响。测试表明，与短标签（如free-cys和C-tag）相比，与GFP和Avi融合的纳米抗体更为敏感。

时间依赖性的不稳定性与测得的热稳定性无直接相关性，因为除了VHH-EGFP，所有构建物的Tm值相当。不稳定性可能受多种因素影响，包括蛋白酶污染或储存缓冲液成分的不同敏感性。

研究证实了大标签对融合纳米抗体的KD有一定的负影响，但并未观察到标签大小和抑制结合之间的直接相关性。例如，EGFP（26 kDa）的影响比较小，而较小的标签CLIP（20 kDa）和Avi（2 kDa）的影响更大，表明其他结构特征可能参与导致抗原-抗体结合减弱。

总结

这项研究对不同的融合标签用于纳米抗体功能化进行了全面评估。

研究结果显示1）使用Sortase A对纳米抗体进行功能化需要进行复杂而耗时的优化，且需要大量底物，与其他替代方法相比，Sortase标签功能化产量较低，因此在实际应用中并不理想。2）除了Avi标签构建物外，所有不同融合标签的构建物均为单体结构。而Avi标签构建物则倾向于形成二聚体，并在一定条件下形成不溶性聚集体。3）构建物的稳定性受所使用标签的影响，与纳米抗体融合的GFP和Avi相比，短标签（如free-cys和C-tag）融合的构建物更为脆弱。4）综合而言，SNAP/CLIP/HALO标签或者自由C末端半胱氨酸等替代标签可能更适合纳米抗体的功能化应用。