7种基于TCR疗法的分子结构

T细胞受体(TCR)复合体是一种天然产生的抗原传感器，它检测、放大和协调细胞对来自细胞表面和细胞内蛋白的表位的免疫反应。TCR能够靶向肿瘤细胞选择性表达的蛋白质，包括新抗原、癌胚抗原和病毒癌蛋白。因此，TCR为新兴的肿瘤治疗提供了基础。在这里，介绍目前使用TCRs和TCR-like分子治疗肿瘤的前景。这包括表达内源性或工程TCR的T细胞过继细胞转移、TCR双特异性结合分子和HLA结合多肽的特异性抗体(TCR mimic)。

与细胞表面和可溶性表位生理结合的抗体不同，TCRs可以对来自整个癌细胞蛋白质组的抗原做出反应。这包括约88%的蛋白质，这些蛋白质只存在于细胞质、细胞核和线粒体等细胞内。TCR结合细胞内抗原的独特能力，这一特性极大地扩大了可操作的免疫靶点的范围，源于它们不与完整蛋白质结合的事实。相反，它们识别结合到HLA分子上的蛋白降解多肽，这些多肽已经被运输到细胞表面用于细胞外呈递。

TCR对配体具有很高的灵敏度。肿瘤细胞表面特异性多肽/HLA(p/HLA)复合体的数量通常在1-100个分子范围内。这个数值比治疗抗体所需的分子数小几个数量级。然而，只有1-3个p/HLA复合体足以触发T细胞效应功能。同时，TCR具有的特异性，可以区分不同于单一氨基酸的多肽，例如由体细胞点突变或生殖系多态引起的多肽，以及相同氨基酸的不同立体异构体。

尽管有这些优点，第一个TCR疗法(Tebentafusp)直到2021年才进入肿瘤治疗的标准。相比之下，抗体及其衍生物，包括抗体-药物结合物(ADC)、双特异性蛋白和CAR修饰的T细胞，自1990s年代中期以来一直是癌症治疗的主要手段。这里介绍了天然产生的TCR的结构，并讨论了合理修改TCR的不同结构域以创造具有不同生化、功能和药理特性的受体的策略。

7种基于TCR疗法的分子结构

内源性TCR

TCR不是一个单一的分子，它是一个蛋白质的复合体，其中抗原识别和信号转导的功能被划分为不同的亚基。TCR的功能单元是由六个蛋白质组成的八聚体复合体：克隆型TCRα/TCRβ半链和不变的CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链(图1a)。这些蛋白质按1：1：1：1的化学计量比组装，其二聚体亚基为TCRαβ：CD3δε：CD3γε：CD3ζζ。少数循环T细胞(γδT细胞)表达TCRγδ，而不表达TCRαβ。TCR半链蛋白都不具有信号转导结构域，相反，受体依赖于与CD3分子的非共价相互作用来启动细胞内信号传递、T细胞激活和细胞命运决定。CD3γ、CD3δ和CD3ε亚基是遗传相关的，只有一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，而CD3ζ亚基是遗传无关的，包含三个ITAMs。

在结构上，每个TCR半链由一个可变(V)结构域、一个恒定(C)结构域、一个跨膜结构域和一个短的细胞质尾组成。TCR多样性和特异性是通过涉及Vα/Vβ结构域的组合和连接多样性产生的。与免疫球蛋白可变重链(VH)类似，TCRVβ结构域的组合多样性是由胚系编码的V、多样性(D)和连接(J)基因片段组成的。Vα结构域类似于免疫球蛋白可变轻链(VL)，由链特异的V和J基因序列重组形成。重组的Vα和Vβ序列依次连接到Cα结构域(由TRAC编码)和两个Cβ结构域之一(由TRBC1和TRBC2编码)。额外的组合多样性来自重组TCRα和TCRβ半链的配对，这两个TCR半链通过位于Cα和Cβ结构域上保守的半胱氨酸残基形成的一个二硫键共价连接。

每个TCR异源二聚体包含6个序列超变区，称为互补决定区域(CDR)。CDR是从TCR的可变区伸出的环状结构，形成与p/HLA复合体的主要接触部位。在CDR之间，每个可变链都有3个框架区域，促进Vα/Vβ结构域的链间堆积和Vα/Cα和Vβ/Cβ结构域的链内界面。CDR1和CDR2环位于TCR暴露于溶剂的末端的外围，并且是胚系编码的。相反，CDR3环位于中央，并通过组合和连接多样化产生，以创建每个TCR多态的序列。除了不同V(D)J基因片段的并置外，CDR3环中的额外多样性是通过删除和添加非模板编码的核苷酸而产生的。

大多数TCR对角对接在p/HLA复合体上，将Vα和Vβ结构域分别放置在与HLA结合的多肽的氨基末端和羧基末端。这种配置在TCR和p/HLA复合体之间建立了广泛的接口。此外，它将TCR序列多样性大的区域（体细胞重排的CDR3环）定位在多肽的中央核心上，在那里它们有助于受体的良好特异性。相反，胚系编码的CDR1环和CDR2环主要(尽管不是排他性的)接触定义HLA分子结合槽的两个α螺旋。这些相互作用确保TCR以肽依赖的方式识别p/HLA复合体。大多数天然存在的TCR具有相对较弱的结合亲和力，典型的解离常数(Kd)测量在微摩尔范围内。相比之下，成熟抗体的亲和力一般在纳摩尔到皮摩尔之间。

外源TCR与基因组编辑

原代人类T细胞的特异性可以通过表达外源TCRαβ基因序列而被基因重定向以识别肿瘤细胞所显示的p/HLA复合体(图1b)。到目前为止，整合逆转录病毒和慢病毒载体是常见的将外源TCRs引入临床应用的方法。然而，非病毒基因组整合技术也可以使用，包括睡美人转座子/转座酶系统和CRISPR-Cas9。尽管有广泛的安全记录，但整合病毒载体具有一定的局限性。病毒以半随机方式整合，拷贝数可变，导致转基因表达异质性。此外，病毒的制造成本很高，可导致插入突变，并且具有相对有限的载货能力。整合病毒载体使内源TCR半链保持不变，这除了正确配对的内源性(α/β)和外源性(α′/β′) TCR之外，这还会导致错误配对的(α′/β，α/β′)异二聚体。内源性和错配TCR的表达可能会通过竞争有限的信号分子池而影响治疗效果。此外，由于错配的TCR没有经过胸腺选择，它们可以具有新的反应性，包括对自身抗原的反应。在同基因小鼠中，T细胞表达错配的TCRs会引发致死性移植物抗宿主病(GvHD)。幸运的是，尚未在人类临床试验中观察到TCR错配导致的GvHD。

为了减少TCR错配，基于核酸酶的基因组编辑技术包括锌指核酸酶、转录激活因子样效应子内切酶和CRISPR-Cas9，可用于干扰内源性TRAC和/或TRBC1/2基因座。然而，这些策略会导致双链DNA断裂，从而有可能产生off-target的基因组效应，包括插入/缺失和染色体易位。抑制性RNA可以在不引起双链DNA断裂的情况下沉默天然TCR的表达，但这种方法不能完全降低错配的风险，因为敲除通常是不完整的。DNA碱基编辑被开发出来，它通过剪接位点失活或引入过早终止密码子来扰乱蛋白质的表达，而不会导致双链DNA断裂。使用DNA碱基编辑对TRAC和TRBC1/2基因座进行操作可能为内源性TCR的基因去除提供一种的替代方法。

除了干扰内源TCR外，CRISPR-Cas9还可能通过模板引导的同源定向修复促进外源TCRαβ基因在TRAC基因座的靶向基因组整合。与半随机插入到基因组中的TCR相比，靶向整合同时提供了增强的功能和更可预测的安全性。靶向整合利用基因的内源性启动子实现了生理抗原受体的调节，这一特征可以防止免疫衰竭。重要的是，使用CRISPR-Cas9的靶向敲入可以通过共电穿孔Cas9 RNP和DNA同源定向修复模板以非病毒的方式执行。这一创新极大地减少了生成临床使用的TCR结构所需的时间和成本。非病毒TCR整合历来不如病毒方法有效。工艺改进可能会提高编辑率，包括单链DNA供体模板、纳米质粒、核内模板穿梭、Cas9 RNP稳定化和小分子鸡尾酒。

结构域工程

TCR结构域工程是提高外源TCR效力和安全性的另一种方法。恒定结构域和跨膜结构域的改变尤其多才多艺，因为它们适用于不同的治疗候选对象。例如，沿着Cα/Cβ界面放置额外的半胱氨酸残基有助于创建第二个链间二硫键，从而增强适当的半链配对。用全部或选定的氨基酸残基鼠源化来代替人的Cα/Cβ序列也可以减少错配。尽管这种方法引入了潜在的免疫原性外源序列，但对接受带有小鼠恒定区的TCR的患者的分析未能发现免疫原性、细胞持久性和临床结果之间的相关性。如果细胞产品中不需要异源序列，则可以将人Cα/Cβ结构域的倒置(结构域交换)作为一种替代方法来大限度地减少错配。恒定链含有翻译后糖基化的残基，通过定点突变去除糖基化位点增强了外源TCR的功能亲和力，可能是通过改善免疫突触内的TCR聚集。在TCRα的S跨膜结构域中，用脂肪残基替代非电离氨基酸可以增加TCR的表面表达。

对TCR可变区的修饰，包括框架和CDR区，也可以改善TCR的功能。与恒定和跨膜结构域改变不同，这些改变需要经验测试和优化。具有相同恒定区的外源表达的TCR在细胞表面的表达并不相同，这一发现表明可变域有助于TCR的组装和稳定性。比较高表达和弱表达TCRs骨架区域的递归氨基酸序列，发现在可变区和恒定区的交界处有3个佳残基。对于含有次优残基的TCRs，用佳氨基酸替代可增强表面表达和体内抗肿瘤效果。重要的是，由于骨架区域不参与抗原结合，这些部位的变化不太可能改变TCR的交叉反应特征。

对选定的CDR残基进行突变可以增强TCR的结合亲和力。这可以通过经验性测试或定向进化技术来实现。与天然序列相比，CDR1、CDR2或CDR3环的单一或组合替代可导致亲和力增加多达100万倍。除了调节结合亲和力外，CDR序列的改变也可能改变TCR的特异性。两项使用亲和力增强受体的临床试验已经导致致命的off-tumor/off-target毒性，可归因于TCR的交叉反应谱的变化。因此，在临床发展之前，有必要对亲和力增强的TCR的交叉反应谱进行详细的评估。尽管早期遭遇挫折，但许多目前处于临床开发中的TCR疗法已经经历了亲和力增强。一种策略借鉴了高度关注特异性的领域(如DNA结合和酶催化)，即设计具有更高特异性的TCRs。这种结构导向的方法不是改变亲和力，而是寻求在TCR-p/HLA界面上重新分配有吸引力的相互作用，以减少off-target多肽识别。

proof-of-concept研究说明了捕获结合工程如何在不改变结合亲和力的情况下增加TCR效力。捕获键是在受体解离之前，在剪切力条件下瞬间形成氢键和盐桥而形成的。这会导致延长的键寿命，导致TCR信号和T细胞激活的增强。捕捉键工程可以通过将极性和带电的氨基酸引入位于p/HLA表面附近但不直接接触的CDR环来实现。这种方法的目标是促进在TCR与p/HLA复合体脱钩期间产生有利的相互作用，类似于鱼钩与猎物的接触。由于捕捉键工程TCR的亲和力通常保持在生理范围内，因此这些受体的交叉反应谱不应改变，因为直接与基态p/HLA复合体接触的残基保持不变。

可溶性双特异性TCRs

TCRαβ异源二聚体可以表达为一种可溶性的单链重组蛋白，使不需要基因工程的现成试剂得以开发。可溶性TCR可与来自激动性抗CD3ε抗体的单链可变区(scFv)融合，从而产生称为“免疫动员抗癌单抗”(ImmTAC)和“T细胞结合受体”(TCER)的双特异性蛋白(图1c)。ImmTACs和TCERs在多克隆T细胞和表达特定p/HLA复合体的靶细胞之间建立人工免疫突触。然而，为了以稳定的方式结合p/HLA复合体作为单体，CDR突变需要将TCR的结合亲和力提高到皮摩尔范围，这一值是天然产生的TCR的10^6倍。改变TCR的结合亲和力到这个程度可能会导致抗原特异性的丧失。在极端情况下，这可能导致高度混杂的受体与特定的HLA分子结合，而不依赖于结合肽的序列。因此，必须仔细评估亲和力增强的TCR的特异性，包括使用大量的抗原和不匹配的靶细胞。使用双特异性TCR重定向的T细胞对表达少至10个p/HLA分子的靶细胞表现出抗原特异性的细胞溶解作用。与单抗(75kDa和150kDa)相比，ImmTAC的分子量较小；因此，它们需要反复输注才能保持效力。延长血清半衰期，例如与修饰的IgG Fc分子融合，可能会克服这一限制。

TCR mimic

另一类双特异性T细胞结合蛋白，称为TCR mimic，使用两个抗体来源的单链抗体，通过多肽接头共价连接。一个scFv与癌细胞上的p/HLA分子表位结合，而另一个scFv与T