发现抑制乙肝表面抗原分泌的新策略

乙肝病毒感染引起的慢性乙型肝炎仍是我国主要的感染性疾病，乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)在慢性乙型肝炎的致病过程中起重要作用。病人血液中高达300μg/ml的HBsAg除了吸附特异性的中和性抗体，还损害人体针对乙肝病毒的免疫反应；经过一段时间的治疗促使病人外周血HBsAg持续性消失被认为是慢性乙肝功能性治的主要标志，其目的是降低慢性乙肝病人发生肝硬化和肝癌的风险。但是目前的药物治疗极少达到HBsAg持续性消失。

已有报道，采用HBsAg特异性抗体和HBV疫苗接种或抗病毒药物的联合治疗措施可使慢性乙肝病人HBsAg持续消失的比例提高。HBsAg特异性抗体的抗病毒效应的机制包括：中和外周血中的游离病毒以防止感染新的肝细胞从而抑制cccDNA池扩增；抗体Fc介导的效应机制；肝细胞内吞抗体抑制HBsAg分泌。内吞的抗体可在细胞内吞体或其它细胞腔室与HBsAg结合形成免疫复合物，并抑制HBsAg分泌。尽管免疫复合物累积在肝细胞内但并未观察到肝脏损伤和其它副作用。目前需要频繁静脉注射HBsAg特异性抗体才能维持有效的血浆浓度，但也降低了病人治疗的依从性。一旦停止抗体治疗，病人血浆HBsAg和病毒DNA载量经常反弹至治疗前的水平，而且HBsAg特异性抗体制备仍然繁琐而且昂贵。

单链抗体(single chain variable fragment, scFv)是将抗体轻、重链可变区通过一段柔性多肽连接而成的重组蛋白，具有与亲本抗体相似的抗原结合特异性，但它的分子量更小(约30kDa)。将scFv与铰链区(hinge domain, HD)、跨膜结构域(transmembrane domain, TMD)及一个或多个细胞内结构域串联可形成嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)。表达CAR的T细胞(CAR-T)可不依赖主要组织相容复合物(major histocompatibility complex)识别和杀伤肿瘤细胞，在治疗血液肿瘤上已显示具有疗效。

课题组前期制备了高亲和力结合包膜蛋白抗原环(antigenic loop, AGL)的G12-scFv(解离常数为1.77×10-10M)，并发现外源G12-scFv可被肝细胞内吞而选择性抑制病毒体分泌(Antiviral Research, 2019, 162: 118-129; Nature Communications, 2022, 13: 4614)，这可能由于在细胞晚期内吞体内G12-scFv与病毒体结合所致。因此，推测内源性表达的G12-scFv或靶向PreS1的MA18/7-scFv可能有效地抑制病毒体或亚病毒颗粒(subviral particle, SVP)分泌。为验证这一假设，应用分泌信号肽将内源表达的G12-scFv或MA18/7-scFv及其CAR或与Fc融合的衍生物转位至内质网和分泌通路，在表达HBV的肝癌细胞系和小鼠模型中评价它们对HBsAg分泌的效应。结果显示G12-CAR能够有效阻止病毒体和亚病毒颗粒分泌，但并不引起细胞内cccDNA扩增；MA18/7-scFv及其CAR还能有效阻止HBV感染肝细胞。在HBV小鼠模型中，Fc融合的G12-scFv和G12-CAR能强烈抑制血清HBsAg(抑制效率高达130倍)；通过AAV载体表达可使抑制效应持续8周以上。深入研究发现，G12-scFv和G12-CAR能使包膜蛋白截留在内质网而阻止HBV出芽（图一），而且这些免疫复合物并不引起细胞毒性和肝脏损伤。上述结果表明，Fc融合的G12-scFv和G12-CAR代表了一种有效降低外周血HBsAg的新方法。此外，这项工作也提示CAR除了应用于T细胞治疗以外，还具有直接抗病毒活性；通过内源表达靶向包膜蛋白的CAR或scFv可用于预防其它包膜病毒感染或通过抑制病毒释放而阻止传播。