抗原TCR-T细胞免疫治疗的当前进展与挑战

使用TCR-T的过继细胞治疗是一种有前景的癌症治疗方法，预计不会有明显的副作用。在人体内，成熟的T细胞具有多样性的TCR，理论上这些受体可以对肿瘤细胞产生的各种随机突变做出反应。然而，目前使用TCR-T细胞治疗的临床试验的结果并不是很成功，特别是在实体瘤方面。该疗法在有效筛选肿瘤特异性抗原及其同源TCR方面仍面临许多挑战。这里介绍基于TCR结构的抗原识别和信号转导，介绍新抗原及其特异性TCR筛选技术的新进展，总结正在进行的针对新抗原的TCR-T治疗的临床试验。还介绍了基于TCR-T细胞的免疫治疗目前面临的挑战，例如病毒载体的安全性、TCR的错配，抑制性肿瘤微环境的阻碍。强调了个性化TCR-T治疗的新见解和方向。

在肿瘤的发生和发展过程中，大量的基因异常，包括点突变、读码移位突变、终止密码子突变、DNA插入和缺失或染色体易位，在肿瘤细胞中积累，并产生许多突变的多肽和蛋白质。如果其中一些突变体被水解为短肽并通过MHC成功地呈递，则可以激活T或B淋巴细胞。这些免疫原性肽被称为新抗原。由于新抗原在正常组织中不表达，它们的特异性T细胞可以逃避胸腺的阴性选择，因此在具有治疗潜力的肿瘤患者中丰富。

基于TCR结构的T细胞激活

有必要在细胞和分子水平上了解TCR的结构和T细胞的激活，以充分了解如何启动有效的抗肿瘤反应，为什么免疫反应无法消除肿瘤细胞，以及如何潜在地修改TCR的结构，使TCR-T细胞能够更好地杀伤肿瘤。

TCR结构

在人类中有两种类型的TCR，即αβTCR和γδTCR，前者占主导地位。TCR是由一个抗原结合亚基(TCRαβ)和三个CD3信号亚基(CD3δε、CD3γε和CD3ζζ)组成的八聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链分别含有1个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，而CD3ζ链包含3个ITAM。整个TCR-CD3复合体总共包含10个ITAM。这些ITAM中的酪氨酸磷酸化在TCR信号转导中起着重要作用。由Src家族激酶Lck磷酸化ITAM启动下游T细胞信号转导。因此，TCR-CD3复合物在发展新的TCR嵌合结构的同时保持结构完整。通过激活TCR复合物的胞外区，它可以激活T细胞并向下游传递信号。Enhancing the Antitumor Immunity of T Cells by Engineering the Lipid-Regulatory Site of the TCR/CD3 Complex报道了一种新的机制，即硫酸胆固醇(CS)与CD3ε的胞质结构域相互作用，以增强其与细胞膜的结合，并诱导稳定的二级结构。这种结构抑制了TCR的磷酸化和信号转导。当CD3ε的ITAM中引入点突变(I/A)时，它会降低二级结构的稳定性，消除CS介导的抑制并增强TCR复合物的信号。该研究首通过揭示TCR/CD3复合信号的信号调控机制，实现了信号增强型TCR-T细胞的合理设计，为今后进一步提高免疫细胞在实体瘤中的疗效奠定了坚实的理论基础。

新抗原是由肿瘤细胞基因组突变产生的，被转录、翻译和切割成不同于正常自身蛋白的多肽。免疫原性新抗原肽与MHC分子(pMHC)结合，需要被TCR识别并启动免疫反应。TCR信号是由pMHC识别肿瘤细胞或抗原提呈细胞而启动的。然后，Lck被募集到TCR-CD3复合体上，使ITAM磷酸化。ZAP70与磷酸化的ITAM结合，并被Lck自身磷酸化。激活的ZAP70随后磷酸化LAT，进而诱导接头蛋白(GRB2、Gads、SLP-76、PLC-γ)的募集。LAT相关效应分子的激活通过3条主要的信号转导通路进行信号转导，钙调蛋白、MAPK和NF-кB信号通路。钙调蛋白信号转导导致NFAT的核易位。MAPK信号导致肌动蛋白聚合和FOS/JUN复合物转录因子AP-1的激活。NF-кB信号转导导致REL和NF-кB转录因子的核易位。

T细胞活化

如果T细胞遇到APC中的pMHC并与之结合，TCR激活程序就会启动。TCR以免疫激酶(IK)或免疫突触(IS)的方式识别pMHC。Kinapse是一个暂时性和不稳定的结构，而Synapse是长期稳定的。T细胞的激活和信号传递依赖于TCR与pMHC的持续接触。T细胞的充分激活需要三个信号：一种是TCR-pMHC复合物介导的抗原特异性信号；另一种是CD28-B7(CD80、CD86)等共刺激信号；细胞因子充当第三信号，在激活的T细胞中提供细胞增殖和生存信号。因此，增强共刺激信号或增加细胞因子的作用是改善TCR-T细胞功能的另一种方法。

重组TCRs

众所周知，CAR-T细胞疗法利用一种能够识别癌细胞表面特定抗原的合成受体，如CD19。由于其固有的高度特异性，CAR-T细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤如急性淋巴细胞白血病方面取得了成功，但在实体瘤中的疗效有限。与CAR-T的单一受体不同，TCR-T免疫疗法使用天然TCR来识别特定的肿瘤抗原。在这个识别过程中，T细胞的激活更具选择性和调节性，从而降低了过度激活和细胞因子释放的风险。然而，在实践中，肿瘤中经常会发生抗原丢失和MHC分子下调。此外，由于MHC类型的个体性，TCR-T治疗的同种异体应用受到限制。为了克服这些局限性，TCR结构修饰以提高免疫治疗效率的研究取得了快速进展，如STAR、AbTCR、ImmTAC等。

STAR-T结合了CAR-T和TCR-T的优点，是一种不依赖MHC的高亲和力TCR-T。STAR是一种抗体-TCR嵌合体，其TCR恒定区与抗体的重链和轻链可变区相连。为了维持天然的TCR信号，可以在TCR的恒定区和胞内区进行基因突变和功能元件的添加。例如，可以将人TCR恒定区hSTAR优化为mutSTAR，该mutSTAR具有高亲和力、高特异性和MHC不受表面抗原的限制。T细胞受体融合结构(TRuC)是由一个基于抗体的结合域(scFv)与TCR亚基融合而成，它可以通过重新编程TCR复合体来有效识别肿瘤表面抗原，并独立于MHC杀伤肿瘤细胞。TCR mimic (TCRm)抗体已被证明能够模拟TCR对肽/MHC I类复合体的特异性，并介导抗体依赖的细胞毒性。Validation and promise of a TCR mimic antibody for cancer immunotherapy of hepatocellular carcinoma构建了一种识别AFP/HLA-A*02复合体的新型TCRm抗体，该抗体具有TCR功能，可靶向肝癌细胞内抗原。Fab片段与TCR的γ和δ亚基融合，形成能够传递信号的抗体-TCR(AbTCR)结构。同时，构建了针对GPC-3的scFv/CD28共刺激分子。通过慢病毒载体将AbTCR和共刺激分子导入T细胞。通过AbTCR信号和CD28共刺激信号促进T细胞的增殖和激活。此外，ImmTAC是一种双功能试剂，它结合了可溶性TCR与细胞内或细胞外肿瘤特异性抗原和抗CD3 scFv抗体的亲和力。这些ImmTAC将T细胞定向到呈递靶标多肽-MHC复合体的肿瘤细胞。IMCgp100是一种识别来自黑色素瘤特异性蛋白gp100多肽的ImmTAC，有效地重定向和激活CD8+和CD4+T细胞的效应细胞和记忆细胞，可诱导广泛的免疫反应。

新抗原和同源TCR预测及筛查策略

新抗原肽与MHC结合的计算预测

发生免疫反应的基本前提是突变的多肽有效地结合到MHC分子上并由MHC分子呈递，从而引发强大的免疫反应。因此，预测MHC分子与多肽结合的概率是当前计算中的关键步骤。已发表的MHC结合亲和力预测算法将配体数据集整合到机器学习算法中，并利用ROC曲线来评估多肽结合或呈递的可能性，包括NetMHC 4.0、MHCflurry、MixMHCpred等。NetMHCpan是一种先进的MHC结合亲和力预测算法，它使用MHC配体的亲和力测量和MS洗脱数据进行训练。通过利用与特征良好的MHC等位基因的同源性，该算法推断潜在的配体偏好，确保其与其他预测工具相比的稳健性和有效性。

新的研究强调了抗原特异性的CD4+和CD8+T细胞之间的协同作用在抗肿瘤免疫中的重要作用。因此，为了有效的抗肿瘤免疫反应，应该考虑能够与个体患者的MHC-II等位基因结合的新表位。人工神经网络已被广泛用于开发MHC-II结合表位的预测工具，包括NetMHCII、NetMHCIIPan、SMMAlign和NNalign用于预测MHC-II结合肽。事实上，与I类工具的准确性相比，MHC-II呈递的新抗原预测仍然具有挑战性。首先，MHC-II的多肽结合槽相对较浅且两侧开放，导致结合肽(9-22个残基)的长度差异很大。其次，MHC-II分子中α和β链的多态性进一步扩大了多肽结合特异性的多样性。第三，关于MHC-II类分子有效结合的数据是有限的，这使得准确训练和验证预测模型具有挑战性。鉴于没有一种预测工具在所有多肽长度和所有HLA类别上都始终如一地表现良好，一些预测工具可以同时结合不同的算法来预测MHC分子的结合呈递，从而提高整体性能。

TCR-pMHC结合的计算预测

近年来，新抗原预测已经从仅仅关注抗原肽转向它与TCR的相互作用(表2)。先前研究发现TCR序列的长度和TCR CDR3内的精氨酸数量都会影响T细胞识别。有研究提出了一种新的策略，用其表位结合的特异性来注释完整的TCR库，并在三个独立的数据集中进行了验证。接种疫苗后抗原特异性TCR谱系增加。人工智能在蛋白质结构预测中的应用可以有效地利用序列和结构信息来构建新型的深度学习网络结构。基于自然语言处理(NLP)的方法可用于从大规模库中预测TCR结合肽。有研究构建了ERGO-AE和ERGO-LSTM模型，分别使用自动编码器(AE)和长短期记忆(LSTM)进行训练。有研究提出一种新的相互作用图识别(ImRex)方法，可用于预测以前未见过的表位，ImRex在已知表位上表现出了卓越的性能，并显示出比标准双输入方法更能推断出与训练数据更相似的表位的能力。上述所有模型都只能支持多肽和TCRβ链序列。然而，TCR的α链也有助于结合特异性。哈尔滨工业大学蒋庆华教授课题组开发的模型DLpTCR，它是用TCR的单链/成对链和多肽相互作用预测的集成深度学习构建的。此外，MHC蛋白也应该包括在表位预测中，因为它们被认为影响表位锚定位置的空间位置。

为了发现T细胞激活的未知结构驱动因素并设计新的多肽配体和疫苗，了解TCR-pMHC空间构象的多肽结合细节是重要的。不幸的是，在蛋白质数据库中只有少数pMHC复合体和TCR-pMHC的3D结构。缺乏关于给定肽的共同结合部位和方向的信息，以及其在TCR-pMHC复合体中的正确对接仍然是预测结构建模方法的重大挑战。虽然人工智能工具Alphafold2提供了卓越的蛋白质结构预测，但其对TCR-pMHC结合构象的预测准确性需要进一步验证。

新抗原预测的综合途径

通常，新抗原的预测始于从肿瘤样本的全外显子组/基因组测序中鉴定所有体细胞突变。然而，并不是所有的突变都能产生有效的新抗原产物。为了识别能够激活T细胞的新抗原，新抗原的预测需要考虑一些因素，如突变类型、蛋白酶体降解、与抗原处理相关的转运蛋白(TAP)、HLA分子结合和递呈以及TCR的识别潜力。现有的新抗原预测的经典完整工作流程可概括为以下几个步骤：①对PBMC或正常组织和肿瘤组织进行全外显子测序(WES)，以鉴定肿瘤特异性突变肽；②通过外周血细胞中的RNA-seq或DNA-seq分析HLA分型；③预测突变肽与MHC分子之间的亲和力；④优先考虑候选肽的TCR识别。目前，已经为每一步建立了许多有价值的生物信息学工具，因此利用各种算法工具的组合，可以确定影响新表位选择和优先顺序的关键参数。这样的佳组合可以形成有效的新抗原预测的综合管道，如TSNAD，TIminer，MuPeXI，Neo-Fusion和pVACtools等。一些预测的新抗原表位在临床试验中显示出有希望的结果 (表1)。例如，1例胶质母细胞瘤患者接种由pVAC-seq预测管道(NCT02510950)生产的合成8个氨基酸多肽(SLP)疫苗，接种后用IFN-γ ELISPOT在外周血中检测到3个HLA-I和5个HLA-II限制性肿瘤抗原。用MuPeXI检测了6例肾透明细胞癌患者外周血中52种诱导CD8+T细胞特异性反应的新抗原。OpenVax可以生产用户指定长度的SLP，3种具有长突变多肽的SLP疫苗已分别在I期临床试验中进行测试(NCT02721043、NCT03223103和NCT03359239)