液相色谱-质谱联用法鉴定海南枫蓼肠胃康颗粒剂血浆代谢产物

 作者：张俊清， 符乃光， 陈峰， 刘明生

【摘要】 　　目的研究大鼠灌胃枫蓼肠胃康颗粒剂后代谢产物的动态，寻找具有代表性可作为该复方药代动力学研究指标成分的代谢产物。方法大鼠灌胃枫蓼肠胃康颗粒剂溶液〔0.9 g·(100 g)-1〕，血浆样品经过酶（G1512）水解后，进行色谱分析，通过与对照品比较研究其血浆中代谢产物动态；采用液相色谱-质谱联用仪检测，大气压电喷雾离子源（EPI）负离子条件下进行扫描，对观测到的代谢产物进行结构鉴定。结果色谱分析的结果表明，枫蓼肠胃康颗粒剂血浆代谢产物中有槲皮素等黄酮类化学成分，同时质谱扫描的结果鉴定出槲皮素（m/z→301.0）的化学结构。结论可以槲皮素为指标成分研究该复方的药代动力学。

【关键词】 枫蓼肠胃康颗粒 液相色谱-质谱联用 槲皮素 代产谢物

　　Abstract:ob[x]jectiveTo study the dynamic state of the me[x]tabolites in rat plasma after oral administration of FengLiaoChangWeiKang Granule and to seek representative me[x]tabolites used as Index components in the compound pharmacokinetic research.MethodsThe rats were orally administered FengLiaoChangWeiKang Granule solution〔0.9 g·(100 g)-1〕. Plasma samples were hydrolyzed with enzyme (G1512). The dynamic state of the me[x]tabolites in rat plasma were studied through analysis of the results by enzyme hydrolyzed with chromatogram and comparison with control article. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry was used for the separation and analysis of the me[x]tabolites in rat plasma. The instrument equipped with an Atmospheric Pressure Ionization-Electrospray (EPI) source was used as detector and was scanned in negative ion mode. The me[x]tabolites were identified with the LC-MS results.ResultsThe results of chromatograph analysis indicated that there were flavonoids such as quercetin in the Feng Liao Chang Wei Kang Granule me[x]tabolites in rat plasma, and quercetin was identified with the results of mass spectrometry, i.e. m/z→301.0. ConclusionQuercetin can be used as an index component in the phamacokinetic study of the compound.

　　Key words:FengLiaoChangWeiKang Granule; LC-MS; Quercetin; me[x]tabolites

海南枫蓼肠胃康颗粒剂由海南地产药材牛耳枫Daphniphyllum calycinum Benth.和辣蓼Polygonum flaccidum Meism.组成，临床上用于治疗急性胃肠炎。本课题组近年对该复方药效物质基础进行了研究，确定了该复方有效部位为由槲皮素等5种黄酮类成分组成的一组混合物，同时采用理化分析和光谱学测试，明确了该5种黄酮类成分的化学结构，该项研究成果已申请国家药物发明专利（申请号：200510071092.3公开号： CN1843418）。本文研究大鼠灌胃枫蓼肠胃康颗粒剂后代谢产物的动态，目的是寻找具有代表性可作为该复方药代动力学研究指标成分的代谢产物。

　　1 材料与仪器

　　1.1 动物雄性SD大鼠从四川省医学科学院四川省人民医院实验动物研究所购买，许可证号：SCXK（川）2004-15。每笼两只，饲养环境温度控制在20℃，适应时间为期两周。大鼠饲料从长沙市开福区东创实验动物科技服务部购买，主要组成为：粗蛋白24.2%，粗脂肪4.5%，粗纤维4.2%，钙1.33%，磷0.8%，含水量6.8%。

　　1.2 仪器Bruker Esquire 2000型质谱仪(瑞士布鲁克公司)，液相色谱仪（包括515型输液泵，2996型光电二极管阵列检测器，717型自动进样器，美国waters公司），DOA-V130-BN真空泵（美国waters公司），CascadeIX超纯水器（美国PALL公司），KR-702型离心机（日本KUBOTA公司），N-EVATM111氮吹仪（美国Organomation ）。

　　1.3 药品与试剂槲皮素由海南医学院药学系药物化学教研室提供，含量大于98％。槲皮素对照品购自中国药品生物制品检定所，批号为100081-200406；Sulfatase（G1512）从Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司购买。甲醇与乙腈均为色谱纯，磷酸、乙酸、盐酸、醋酸乙酯等试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

　　1.4 血浆样品采集称取SD大鼠（200～260 g）置于代谢笼中，禁食12 h，自由饮水，以0.9 g·(100 g)-1的剂量灌胃（ig）给药枫蓼肠胃康颗粒溶液，给药后8h内从腹腔静脉取血（约5 ml），全血样品置已肝素化的试管中，于4℃下3 000 r·min-1离心10 min以分取血浆，置-40℃冷冻贮存，备用。

　2 方法

　　2.1 色谱条件色谱条件：Diamonsill C18柱（250 mm×4.6 mmID,5 μm粒径）（迪马公司），流动相为乙腈-1.0%冰醋酸溶液（50∶50）,波长200～400 nm，流速为1 ml·min-1，温度为30℃。

　　2.2 质谱条件 EPI离子源，阴离子方式检测，扫描范围m/z 50～2 200，用于定性分析的离子分别为m/z→301（槲皮素）。

　　2.3 血浆样品处理取900 μl血浆于4 ml小瓶（waters，P/N186000838C，）加入100 μl浓度为0.583 mol/L的乙酸溶液调节pH至4.9，漩涡混匀，加入2.5×104U/L Sulfatase（G1512）水解酶，密闭。在37℃水浴中水平振荡60 min，加入6倍于取样体积的丙酮水平振摇30 min，样品在4℃下以4 000 r/min离心30 min，合并上清液N2吹干，再用0.5 ml甲醇溶解残渣，过0.45 μm滤膜，得样品，进样40 μl［1,2］。

　　3 结果

　　3.1 色谱结果血浆样品色谱检测结果显示，与空白对照相比，出现几个黄酮类代谢产物，其中保留时间为8.627 min为槲皮素。见图1～3。
　
　　3.2 质谱结果采用电喷雾离子源，以负离子方式对大鼠给药枫蓼肠胃康颗粒后经酸水解血浆样品进行检测。从全扫描质谱图中获得样品中槲皮素的分子离子峰为m/z 300.9，可确定样品中确实存在槲皮素。见图4。
　
　　4 讨论

大鼠灌胃枫蓼肠胃康颗粒剂后其代谢产物研究中鉴定出了槲皮素，另外几种黄酮类成分由于现有对照品及实验条件的局限性无法确认，因此，完全弄清楚大鼠灌胃枫蓼肠胃康颗粒剂后的血浆动态还有待今后进一步研究确定。

进一步质谱分析的结果对于槲皮素的鉴定结果，表明我室有关枫蓼肠胃康颗粒剂的药代动力学研究可以槲皮素为指标成分进行研究。

【参考文献】
　　［1］Ader P, Wessmann A, Wolffram S, et al. Bioavailability and me[x]tabolism of the flavond quercetin in the Pig［J］.Free Radic Biol Med,2000,28(7):1056.

　　［2］Manach, C., Morand, C., Demigne, C., et al. Biovailability of rutin and quercetin in rats［J］.FEBS Lett, 1997, 409:12.