囊性纤维化跨膜转导调节因子表达率与人精子受精能力的关系

作者：李楚艳1,2,李坤2,陈璋辉2,于建民2　　作者单位：1. 温州医学院 检验医学院、生命科学院，浙江 温州 325035;2.浙江省医学科学院 生殖医学研究中心 生殖生理研究室，浙江 杭州

　　【摘要】目的：研究人精子囊性纤维化跨膜转导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conduc-tance regulator，CFTR)表达率与精子受精能力间的关系。方法：运用间接免疫荧光法及蛋白印迹分析法研究CFTR在人精子上的表达及其在不同类型(生育组、不明原因性不育组及不育组)精子上的表达率情况。结果：通过间接免疫荧光法发现CFTR表达在人精子赤道板上，蛋白印迹分析进一步证实人精子中存在CFTR，分子量为170 kD;采用间接免疫荧光技术，CFTR在生育组、不明原因性不育组及不育组(包括畸形精子症、弱精症、少精症)上的表达率有显著差异：CFTR在生育组精子上的表达率(88.13%±3.79%)远高于不明原因性不育组(52.93%±15.36%)及不育组(35.89%±20.41%)(P?<0.01)。结论：CFTR表达率下降与人精子受精能力降低有关。

　　【关键词】 囊性纤维化跨膜转导调节因子;表达率;人精子;受精能力

　　Abstract: ob[x]jective: To investigate the correlation between percentage of human sperm expressing CFTR and sperm fertilizing capacity. Methods: The ex[x]pression of CFTR on spermatozoa was conducted by indirect immunofluorescence staining and Western Blot Analysis. And the percentage of spermatozoa expressing CFTR from fertile， unexplained infertile and infertile men?(mainly teratospermic， asthenospermic and oligospermic)?was examined with indirect immunofluorescence staining. Results:CFTR protein was localized to the equatorial segment of sperm head and molecular weight was approximately 170 kD. And the percentage of spermatozoa expressing CFTR in fertile men was signifi-cantly different from that in the unexplained infertile men and infertile men categories，the fertile men spermatozoa greatly higher?(88.13%±3.79%)than that the unexplained infertile men (52.93%±15.36%) and infertile men (35.89%±20.41%) (P?<0.01). Conclusion: The defective ex[x]pression percentage of CFTR in human sperm is related to a reduction of sperm fertilizing capacity.

　　Key words: CFTR;ex[x]pression percentage;human sperm;sperm fertilizing capacity

　　囊性纤维化病(cystic fibrosis，CF)是由囊性纤维化跨膜转导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conduc-tance regulator，CFTR)基因突变引起的一种遗传性疾病，其临床表现是进行性肺衰竭、胰腺功能不全及两性不育等。将近97%男性CF患者因为先天性双侧输精管缺失(CBAVD)[1-2]、先天性单侧输精管缺失(CUAVD)[3]及杨氏综合征(Young’s syndrome)[4]而致不育。Van der Ven等[5]报道17.5%男性不育是因为精子质量下降，14.3%少精症患者至少有一个CFTR基因突变，这些结果指出CFTR除了对附睾腺及输精管发生有重要作用以外，也可能参与精子的发生和成熟。我们以前的研究表明CFTR表达在精子赤道板上，且与小鼠精子生殖能力相关[6]，那么成熟人精子上CFTR表达率是否与精子生殖能力有关?CFTR在精子上的表达率是否能作为评价精子受精能力的指标?为此我们进行了深入研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 主要试剂：CFTR抗体是从Abcam公司(英国)购买的鼠源性单克隆抗体(CF3 Ab2784)，保存在-20 ℃以备用。兔免疫前IgG购于R&D Systems Inc(美国);鼠源β-actin抗体为上海碧云天生物技术有限公司产品。辣根过氧化酶交联的羊抗鼠IgG以及Alexa fluor 488交联的羊抗鼠IgG均购自Molecular Probes公司(美国)。Hochest 33258 购于Sigma 公司(美国)。封闭用的羊血清由北京成文免疫研究室提供，硝酸纤维素膜购自Bio-Rad公司(美国)，X-胶片为日本富士株式会社产品。研究用的100 mL PBS工作液包含有0.818 g NaCl，0.02 g KCl，0.027 g KH2PO4，0.287 g Na2HPO4·12H2O。

　　1.1.2 精液标本：根据WHO规定，本研究中正常精液参数标准：密度≥20×106/mL;活力(a+b)%≥50%;正常形态%≥15%。生育男性(年龄在27～39岁之间)是指其配偶在1年内已自然受孕且精液常规分析参数在正常范围之内的男性;不明原因性不育男性(年龄在23～41岁之间)是指其配偶在没有采取任何避孕措施情况下1～2年内没有自然受孕的患者，但其精液常规分析参数在正常范围之内;不育男性(年龄在25～40岁之间)指其配偶在没有采取任何避孕措施情况下1～2年或2年以上没有自然受孕的患者，并且其精液常规分析参数不在正常范围之内，包括畸形精子症(正常形态%<15%)、弱精子症[活力(a+b)%<50%)]和少精子症(密度<20×106/mL)。经浙江省医学科学院人类伦理委员会同意，生育组精液标本(n?=20)是生育男性手淫法取得的精液标本。不明原因性不育组(n?=25)精液标本及不育组(n?=55)精液标本均来自浙江大学附属邵逸夫医院生殖中心。每位患者都获得知情权，并填写了问卷调查以排除其他相关因素如年龄、工作条件、饮食习惯、吸烟情况、健康状况。各型精液参数见表1。精液用PBS液离心(1?800 r/min，5 min)洗3次去除精浆后用4%多聚甲醛固定，4 ℃过夜备用。

　　1.2 方法

　　1.2.1 间接免疫荧光染色法：已固定的精液标本用PBS液离心(1?800 r/min，5 min)洗3次后涂于硅烷化玻璃片上，并于室温晾干。然后用0.1% TritonX-100/PBS破膜10 min，用PBS液洗3次(5 min/次)。随后用10%的羊血清在室温下封闭1 h。弃去封闭液，将CFTR抗体(1:500) 溶于10%羊血清中，加在玻片上，置于4 ℃湿盒中(防止玻片干燥)反应过夜。第2天弃去一抗后用PBS液洗3次(10 min/次)，在避光环境下将二抗(Alex fluor 488交联羊抗鼠，1:500)稀释于10%羊血清中，加在玻片上，室温孵育1 h。用PBS液洗3次(10 min/次)，DAPI(1μg/mL)或Hochest 33258(1μg/mL)染色10 min。然后用PBS洗3次(10 min/次)，吹干后在荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i;Nikon Inc.，Tokyo，Japan)下观察。观察200个精子并计算CFTR在各类精子上的表达百分率。

　　1.2.2 精子膜蛋白的提取：将人精子标本用预冷PBS液离心(1?800 r/min，5 min)洗2次，弃上清，精子沉淀加入适量10% SDS膜蛋白裂解液(精子数不超过1×106 cells/mL)，用1 mL注射器(小号针头)反复抽打裂解液(室温)，直至液体不黏稠为止。离心(12?000 r/min，10 min)后，取上清，移入干净Eppendorf管，置于37 ℃水浴中变性2 h后，加入2×上样缓冲液，混匀，分装，于-20 ℃冰箱保存。

　　1.2.3 蛋白印迹分析法：①SDS-PAGE的制备：安装玻璃板，先制备15%分离胶10 mL。灌注分离胶至梳齿下1 cm，并在胶溶液上方覆盖异丙醇，压平凝胶，可见明显分层，室温下静置45 min。待分离胶聚合完全后，制备5% PAGE积层胶5 mL，倒出异丙醇，灌注积层胶，并插入干净的梳子，室温下聚合30 min。将凝胶固定在电泳装置上，电泳槽中加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，然后移出梳子。②电泳：两孔分别上样20μg和40μg蛋白，并同时上样5μL预染Marker(Bio-Rad，USA)。开始时电压为80 V，待溴酚蓝成一条线后，将电压增加到100 V，直至Marker小分子蛋白明显分离。③电转：卸下玻璃板，去除多余凝胶。合适大小的PVDF膜先在甲醇溶液中浸泡30?s，移入1×电转缓冲液平衡30 min。将凝胶与滤膜紧贴，两侧各贴上一层滤纸(Extra thick，Bio-Rad)，夹在多孔海绵中，装置电转槽，于碎冰中，电转90 min(恒流200 mA)。④封闭：电转结束后，将PVDF印迹膜剪角标记方向，用甲醇溶液浸泡30 s，再用TBS/T洗膜3次，每次10 min。然后放入封闭液中，水平摇床上室温孵1 h。⑤一抗孵育：弃去封闭液，加入一抗溶液(CFTR，1:1?000;β-actin，1:1?000，用封闭液稀释)，4 ℃摇床孵育过夜。弃去一抗溶液，用TBS/T溶液洗3次，每次10 min。⑥二抗孵育：加入二抗溶液(CFTR：辣根过氧化酶交联的羊抗鼠IgG，1:1?000，β-actin：辣根过氧化酶交联的羊抗鼠IgG，1:2?000)，室温摇床孵育1 h。弃去二抗溶液，用TBS/T溶液洗3次，每次10 min。⑨显影：取ECL试剂A液、B液等体积混合，加在膜上反应2 min后以保鲜膜包裹，压在Kodak胶片上，暗盒曝光10 s～3 min。胶片浸入显影液，一旦出现清晰条带中止显影。蒸馏水冲洗，浸入定影液1 min，自来水冲洗、晾干。

　　1.3 统计学处理方法 精子CFTR表达率采用单因素方差分析及Dunnett’s post hoc test进行检验。

　　2 结果

　　2.1 CFTR在人精子中的表达及定位 间接免疫荧光实验结果显示，CFTR在人精子上有特异性表达，并定位于人精子头部赤道板上如图1(A)。另外，我们用蛋白印迹分析实验进一步证明人精子中存在CFTR蛋白，分子量为170 kD，两个条带的蛋白上样量分别为20μg和40μg如图1(B)。

　　2.2 CFTR在不同类型人精子上的表达 间接免疫荧光实验结果显示，CFTR在不同种类精子上的表达情况有显著差异如图2(A～C)。数200个精子计算表达率，结果显示CFTR在生育组精子上的表达百分率与不明原因性不育组及不育组相比差异有显著性。CFTR在生育组精子上的表达率(88.13%±3.79%)远高于不明原因性不育组(52.93%±15.36%)及不育组(35.89%±20.41%)(P?<0.01)如图3，表明CFTR表达率下降与精子受精能力降低有关。

　　3 讨论

　　CFTR是cAMP激活的阴离子通道，其基因突变能导致两性不育[7-8]。我们以前的研究表明，CFTR表达在小鼠及人精子赤道板上，且其是小鼠和豚鼠精子获能所必须的[6，9-10]。CFTR在人精子上的表达率是否与精子受精能力有关呢?研究显示CFTR表达在人精子赤道板上，蛋白印迹分析实验进一步证明CFTR在人精子上有表达，分子量为170 kD，其结果与以前一致[6]。通过计数精子CFTR表达百分率，我们发现CFTR在生育组与不明原因性不育组及不育组(主要包括畸型精子症、弱精子症、少精子症)精子上的表达百分率差异有显著性，生育力正常的生育组精子的CFTR表达百分率明显高于生育力下降的不明原因性不育组及不育组，表明精子CFTR表达率下降与精子受精能力降低有关。

　　精子功能正常与否对临床选择IVF还是ICSI治疗不育症极为重要。多年来，在科研及临床工作中常用于判断精子生殖力的指标是精液常规分析，包括精液总量、液化时间、前向运动精子百分率、活精率、畸形精子百分率及精子密度等。尽管精液常规分析在一定程度上反映了精子的生殖能力，然而只依靠精液常规分析的结果来预测男性生育状况仍是很不准确的[11]。例如本研究中的不明原因性不育组，精液常规分析参数是正常的，但其生育力是降低的，所以除了精液常规分析，需要更加可靠的指标来反映精子受精能力。本研究表明，生育力正常的生育组精子的CFTR表达率远远高于生育力下降的不明原因性不育组及不育组，证明了精子CFTR表达率下降与精子受精能力降低有关，因此CFTR表达率可能作为评价精子生殖能力的依据之一。

　　CFTR表达率具体与精子受精能力的哪一环节或哪几个环节相关(获能、顶体反应还是精卵融合)?CFTR表达在精子赤道板上(赤道板是精子和卵子膜融合的部位)，那么CFTR表达率与IVF及ICSI成功率是否相关?这些都有待我们进一步深入研究。

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