hURAT1基因3′非编码区SNP筛查及与原发性高尿酸血症的关系

    作者：吕森森,吴秀英,韩琳,王瑶,李长贵　　作者单位：青岛大学医学院附属医院内分泌科，山东 青岛 266003

　　【摘要】目的在人尿酸盐转运蛋白1(hURAT1)基因3′非编码区(3′UTR区)筛查与原发性高尿酸血症关联的单核苷酸多态性(SNP)。方法 对原发性高尿酸血症病人273例、健康体检者429例(正常对照组)，采用酚-氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA，特异性引物扩增3′UTR区，并进行基因测序，对基因型及频率进行分析。结果 共检测到3种SNP，分别为1925 G>A、del G 1951及G 2174 A，上述SNP位点所组成的基因型频率在高尿酸血症病人组和正常对照组差异无显著性。2例原发性高尿酸血症病人hURAT1基因3′UTR区第1827-1828位2个碱基缺失(del TC 1827-1828)，这2例病人的血尿酸水平明显高于其他病人，正常对照组未检测到该缺失。结论 3′UTR区存在3个SNP位点,其中del TC 1827-1828位点可能是原发性高尿酸血症致病位点。

　　【关键词】 高尿酸血症;人尿酸盐转运蛋白1;基因型;基因频率;单核苷酸多态性

　　POLYMORPHISMS IN 3′-UNTRANSLATED REGION OF URATE TRANSPORTOR 1 RELATED TO HYPERURICEMIA　　L SEN-SEN, WU XIU-YING, HAN LIN, et al　　Department of Endocrinology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China

　　[ABSTRACT]ob[x]jective To find new single nucleotide polymorphisms (SNP) in 3′-untranslated region (3′UTR) of urat1 related to primary hyperuricemia.Methods　This study consisted of 273 patients with primary hyperuricemia (PH), and 429 healthy volunteers. DNA was purified from peripheral blood and 3′UTR of the URAT1 gene was sequenced. The genotype and its frequencies were analyzed.Results Three kinds of SNP were found: 1925 G>A, del G 1951 and G 2174 A. The differences of genotype frequencies between the groups were not significant. The del TC 1827-1828 was absent in two patients, but no absence observed in healthy volunteers. These two patients showed a higher serum uric acid (573 μmol/L,630 μmol/L VS 499.69±136.08 μmol/L) than the rest in the same group. Conclusion Three SNP sites were detected in 3′UTR region, in which, the del TC 1827-1828 is likely to be the pathogenic site of hyperuricemia.

　　[KEY WORDS]Hyperuricemia; Human urate transportor 1; Genotype; Gene Frequency; Single nucleotide polymorphism

　　人尿酸盐转运蛋白1(hURAT1)是位于近端肾小管上皮细胞特异表达的尿酸转运蛋白，是维持血尿酸水平的关键离子通道，是原发性高尿酸血症的重要候选基因。国内外以及我们课题组的研究结果表明，该基因的单核苷酸多态性(SNP)和突变与血尿酸水平密切相关[1～9]。目前发现的SNP和突变位点主要位于hURAT1基因的外显子、内含子和启动子区域，在3′非编码区(3′UTR区)尚未发现与原发性高尿酸血症密切相关的SNP位点。3′UTR 在基因的转录调控中发挥重要作用[10～13]。3′UTR的基因变异虽然不直接改变hURAT1基因的编码序列，但可引起hURAT1基因功能的改变。原发性高尿酸血症是多基因遗传性疾病。同一基因不同位点的SNP和突变均可参与原发性高尿酸血症的发病。本研究对273例原发性高尿酸血症病人和429例正常体检者hURAT1基因3′UTR区SNP和突变位点进行筛查，以期发现与原发性高尿酸血症相关的SNP或突变位点。现将结果报告如下。

　　1 对象和方法

　　1.1 研究对象

　　原发性高尿酸血症病人(病人组)273例，男228例，女45例;年龄16～85岁，平均(49.88±15.06)岁。病人均来自青岛大学医学院附属医院内分泌科病房和门诊。原发性高尿酸血症诊断参照第6版《内科学》教材，即绝经前女性尿酸>350 μmol/L，男性和绝经后女性尿酸>420 μmol/L。排除因肾脏、肝脏、心脏、血液病及药物等引起的继发性高尿酸血症。选取同期健康体检者429例作为正常对照组，其中男224例，女205例;年龄20～86岁，平均(42.98±13.67)岁。所有研究对象均无高尿酸血症或痛风病史及家族史，无心脏、肾脏、肝脏等器质性疾病。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 外周血DNA抽提

　　酚-氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA。用红细胞、白细胞裂解液裂解红细胞和白细胞，加入蛋白酶K后45 ℃消化过夜。次日加入等体积新配制的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合液，抽提DNA。双蒸水溶解至50 mg/L备用。

　　1.2.2 目的片段的扩增和基因型分析

　　多聚酶链反应(PCR)扩增URAT1基因的3′UTR，扩增片段长度为 1 112 bp,上游引物5′-TGGCATTCCCTG-GAGTCCTT-3′，下游引物5′-CACAACAGGCGCT-GGAAAC-3′。 20 μL反应体系包括：10×Taq reaction Buffer 2 μL，25 mol/L MgCl2 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，2 μmol/L上下游引物各1 μL，50 mg/L DNA稀释液 1 μL，2.5×106U/L Taq DNA Polymerase 0.5 μL，用去离子三蒸水补齐至20 μL。PCR反应条件：预变性95 ℃ 5 min，然后94 ℃变性40 s、66 ℃退火40 s、72 ℃延伸90 s，35个循环后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳，确定扩增片段为所需目的片段。将PCR产物纯化，根据Sanger双脱氧链终止法原理测序。测序引物分别是5′-GAGTCCTTGGGATGGACACA-3′,5′-CTTGCCAACCCTCTGCTT-3′。

　　1.3 统计学分析

　　正态分布计量资料用x±s表示，数据间比较采用t检验及χ2检验。用Hardy-Weinberg检验确认标本的群体代表性。采用PPMS 1.5[14]统计软件进行处理。

　　2 结果

　　2.1 两组生化资料的比较

　　原发性高尿酸血症病人组三酰甘油(TG)、尿酸、尿素氮(BUN)明显高于正常对照组，差异具有显著性(t=5.639～23.210,P<0.001)。见表1。表1 正常对照组与病人组生化资料比较(略)

　　2.2 各SNP位点的Hardy-Weinberg 遗传平衡分析及基因型与原发性高尿酸血症的相关性

　　对SNP位点进行遗传平衡分析显示，正常对照组与病人组标本代表性较好(χ2=0.17～0.36,P>0.05)。共检测到3种SNP，分别为1925 G>A、del G 1951及G 2174 A，上述SNP位点所组成的基因型频率在高尿酸血症病人组和正常对照组差异无显著性(χ2=2.55、1.33、0.93,OR=1.71、0.84、0.86,P>0.05)。见表2。2例原发性高尿酸血症病人hURAT1基因3′UTR区第1827-1828位2个碱基缺失(del TC 1827-1828)，这2例病人的血尿酸水平明显高于其他病人，正常对照组未检测到该缺失。表2 Hardy-Weinberg遗传平衡、基因型与疾病相关性分析(略)

　　2.3 两组间单倍型频率比较

　　本文3个SNP位点主要形成5种单倍型，正常对照组和病人组单倍型频率差异无显著意义(P>0.05)。见表3。表3 两组单倍型频率比较(略)

　　3 讨 论

　　hURAT1是近年来发现的维持血尿酸水平的关键离子通道，hURAT1基因的异常表达可直接导致低尿酸或高尿酸血症[1～9]。GRAESSLER等[3]研究显示，hURAT1基因第2外显子C426T多态性与德国人群肾尿酸排泄减少和高尿酸血症显著相关，相对于CC基因型，CT和TT基因型个体肾脏排泄分数明显降低，血尿酸水平明显升高。YUKIO等[4]研究显示，日本男性受试者中hURAT1第4内含子G/T多态不同基因型者(GG、GT和TT)血尿酸水平明显不同，GG基因型者血尿酸水平高，GT基因型者次之，TT基因型者低，提出在日本人群中，该SNP位点可作为独立的高尿酸血症预测标记。VA ZQUEZ-MELLADO等[5]对墨西哥原发性痛风病人及一级家属和120名健康个体的hURAT1基因序列分析结果显示，69例原发性痛风病人中16例存在hURAT1基因突变，占病人的23%，其中5种突变位于第5 外显子，1种突变位于第4外显子，提出上述突变可能与原发性高尿酸血症有关。提示hURAT1基因SNP或突变与原发性高尿酸血症密切相关。

　　人类基因的转录翻译是一个相当复杂的过程。 hURAT1基因3′UTR区SNP和基因突变可导致该基因功能的改变，是原发性低尿酸血症发病的重要原因。ANZAI等[6]的研究显示，日本人群hURAT1基因3′UTR区存在del GTCCT 1639-1643 [rs61157735(-/GCCCT)]多态，该多态导致肾性低尿酸血症。GRAESSLER等[5]研究显示，德国原发性高尿酸血症病人URAT1基因的3′UTR存在1703-1705 位CCT碱基的缺失。本研究在正常人群和原发性高尿酸血症病人中均未发现上述多态性位点和碱基缺失, 说明3′UTR的SNP和突变存在种族差异。

　　本研究结果显示，hURAT1基因3′UTR存在3个SNP位点：1925 G>A、del G 1951(rs11287614)及G 2174 A，和一个突变位点del TC 1827-1828。其中1925 G>A和G 2174 A是国际上在该区域发现的SNP位点，虽然这2个SNP位点在正常人群和原发性高尿酸血症人群中均出现且基因型频率差异无显著性，但由于在其他种族中均未发现该位点的存在，且在中国人群中出现频率较高，提示这2个SNP位点可能是遗传标记。

　　本研究显示，3′UTR 区尚存在1827-1828位TC碱基的缺失，由于该缺失只在原发性高尿酸血症病人中出现，在429例正常人群中无此缺失，因此该缺失为突变。对突变携带者进一步研究显示，突变携带者血尿酸水平明显高于病人组其他病人，提示del TC 1827-1828可能与原发性高尿酸血症有关。该点突变可能通过下列机制导致高尿酸血症：①碱基缺失引起3′UTR端阅读框架发生改变，转录终止点或剪切位点发生改变;②抑制局部micro RNA形成，使基因转录活性增强;③TC 碱基缺失后，polyA长度改变，增强mRNA稳定性和转录翻译效率。转录翻译后URAT1基因表达增强，对尿酸的重吸收增多，导致高尿酸血症。由于该点突变只在2例原发性高尿酸血症的病人中检出，检出率仅为0.733%，提示该点突变虽然可能与原发性高尿酸血症有关，但不是导致原发性高尿酸血症的主要原因。

　　综上所述，中国山东沿海地区人群hURAT1基因的3′UTR存在3个SNP位点，与原发性高尿酸血症的关联不明显，可作为中国山东沿海地区人群正常基因组遗传标记;1827-1828位TC碱基的缺失可能与原发性高尿酸血症相关，需扩大样本量进行筛查，并通过功能实验进一步证实该碱基的缺失是否与hURAT1基因的高表达有关。

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