Hepsin、Maspin在宫颈疾病中的表达及其临床意义

        子宫颈癌是全球妇女中常见的恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶性肿瘤半数以上，患者近年来有年轻化的趋势。hepsin基因位于人染色体19qll - q13.2上，hepsin在宫颈癌细胞中的研究国内外报道极少。maspin基因证实其为丝氨酸蛋白酶抑制基因陋3，其与宫颈癌的关系国内报道较少。本研究从核酸水平和蛋白水平检测hepsin和maspin在宫颈癌中的表达情况，并研究二者在官颈癌发生发展中的关系，探讨对宫颈癌的诊断、治疗、预后及放化疗后的病情判断有一定的参考价值。 
        1 资料和方法 
        1.1资料
        1.1.1 实时荧光定量逆转录一多聚酶链反应( Real -time fluorescent quantitative reverse transc[x]riptasepolymerase chain reaction，QRT - PCR)法 收集2009年9月至2010年4月广东医学院附属医院妇产科新鲜手术标本65例。所有患者术前均未接受放疗和化疗。正常宫颈组织20例，官颈上皮内瘤变( cervical intraepithelial neoplasia, CIN)组13例，其中CIN I 3例，CINⅡ2例，CINⅢ8例，官颈癌组32例。 
        1.1.2兔疫组化 收集2009年9月至2010年5月广东医学院附属医院妇产科新鲜手术标本和2007年4月至2010年5月广东医学院附属医院病理科存档蜡块共计127例。所有患者术前均未接受放疗和化疗。正常宫颈组织20例，CIN组45例，其中CIN I9例，CINⅡ8例，CINⅢ28例，宫颈癌组62例。 2组资料均根据2000年国际妇产科联盟( FICO)修订的临床分期方案进行临床分期。根据1988年国际妇科病理协会(ISGP)肿瘤病理分级方案进行组织学分级。65例做QRT - PCR同时取标本行免疫组化试验，以排除不同个体之间的差异。 
        1.2仪器和试剂 
        1.2.1 实时定量PCR ABI PRISM 7300荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司，U．S．A），连续光谱荧光酶标仪（Thermo Electron corporation）；TRIzolReagent( Cat: N0 15596 - 026, Invitrogen公司)4cC保存，One Step SYBR Primesc[x]ript TM RT - PCR kitⅡ（大连宝生物工程有限公司）一20℃保存；PCR引物（大连宝生物工程有限公司），以18SrRNA作为肉参照。详见表1。 

        1.2.2免疫组化兔抗人Maspin（H-130）多克隆抗体（sc - 22762），购自美国Santa Cruz Biotechnology.Inc.，适用稀释浓度1：50；兔抗人Hepsin多克隆抗体( ab27765)，购自abcam( Hong Kong)，适用稀释浓度1：40；SP - 9000通用型试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
        1.3方法
        1.3.1实时定量PCR利用生物信息学(http：//www. ncbi. nil. nih．gov)和参考文献找出基因序列，以18SrRNA为内参照，由大连宝生物工程有限公司合成。官颈组织总RNA抽提后参照大连宝生物工程有限公司的One Step SYBR Primesc[x]ript TMRT - PCR kitⅡ说明书进行逆转录反应，总体积20ul。将八连管置于7300荧光定量PCR仪上，扩增条件：Stagel：42℃逆转录5 min; Stage2：95℃预变性10 s；Stage3：95℃变性5 s，600C退火、延伸31 s(50
个循环)；Stage4：ABI7300系统自动添加。根据公式RQ=2-△△Ct进行数据处理。 
        1.3.2 免疫组化 染色参见SP - 9000说明书，DAB显色，以PBS代替一抗作为阴性对照，Hepsin以肝癌细胞作为阳性对照，Masppin以生物公司提供的阳性切片为阳性对照。 
        1.3.3 免疫组织化学结果判定 每一批免疫组化均设已知阳性对照和用PBS代替一抗的空白对照。显微镜下细胞核和／或细胞浆中出现棕黄色或褐色颗粒为阳性染色细胞。由两名正职称病理诊断医师分别对实验结果进行双盲法评估。每一切片随机选择4个低倍视野( xl00)．在高倍镜(x400)下计数每个视野100个肿瘤细胞，非癌组织则计数着色区100个细胞中阳性细胞的比例，根据切片的肿瘤细胞阳性细胞数比例和染色强度对结果进行半定量评分判定，避开肿瘤边缘及坏死区域，取4个视野的平均百分数为判定结果。 肿瘤细胞阳性细胞数比例评分标准：I级0分，≤10%；Ⅱ级1分，11%- 240-/0；Ⅲ级2分，25% -50%；Ⅳ级3分，>50%。染色强度评分标准：无染色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；深棕色为3奇=免疫组化结果根据染色阳性细胞数和染色强要分别评分，两者乘积0 -1分为阴性（一）；2-4分匈弱阳性(+)；5 -6分为阳性(++)；6分以上强翠性(+++)。其中（一）和(+)记为低表达，(++)司(+++)记为高表达。 
        1.4统计学处理 采用统计学软件SPSS 13.0进行统计分析。实爱数据计量资料以x+s表示，比较采用f检验或方差分析（两两比较采用q检验），计数资料比较采用、一检验，相关分析采用Spearman等级相关。P<0. 05为差异有统计学意义。 
        2.结果
        2.1实时定量PCR结果
        2.1.1hepsin的表达与临床关系 结果显示hepsin的表达在CIN I、Ⅱ、Ⅲ中是正常宫颈组织的4.4倍；在宫颈癌中是正常宫颈组织的12.7倍，随着宫颈癌级别的增高而增高，即hepsin的表达与宫颈癌病情呈正相关。详见表2、3，图1、2。

　　
　　
        2.1.2maspin的表达与临床关系 
        结果表明
        maspin的表达在CIN中是正常官颈的0.7倍；在宫颈癌中是正常官颈的0.3倍，随着宫颈癌级别的增高而降低，即maspin的表达与宫颈癌病情呈负相关。详见表4、5，图3、4。 2.2免疫组化结果
        2.2.1Hepsin蛋白在正常宫颈、CIN和官颈癌组织中的表达情况 Hepsin蛋白主要表达于宫颈癌细胞的细胞膜和细胞质中，染色为深褐色。Hepsin的表达在正常官颈、CIN和宫颈癌间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。但在CIN I、Ⅱ、Ⅲ三组间比较因样本量过少，无统计学意义(P>0.05)。详见表6。 
        2.2.2 Maspin蛋白在正常宫颈、CIN和宫颈癌组织中的表达情况 Maspin蛋白主要表达于正常宫颈细胞的细胞腆和细胞浆中，染色为深褐色。Maspin的表达在正常宫颈、CIN和宫颈癌间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。但是CIN I、Ⅱ、Ⅲ三组间比较因样本量过少，无统计学意义(P>0.05)。详见表7。

2.2.3宫颈癌中Hepsin、Maspin蛋白表达之间的相互关系 62例宫颈癌标本中，Hepsin与Maspin同时表达阳性为27. 40-/0( 17/62)，同时表达阴性为9.7%( 6/62)，两者表达呈负相关(r=-0.276，P<0. 05)。详见表8。 
        二．2.4官颈癌组织中Hepsin、Maspin与临床病理因素的关系 62例宫颈癌标本中，Hepsin、Maspin两种蛋白的表达与患者年龄、组织类型和淋巴转移无统计学意义(P>0.05)；而与临床分期有统计学意义(P<0.05)。随着宫颈癌临床分期的增高Hepsin的表达增强，而Maspin的表达降低或缺失。详见表9。 52例宫颈鳞癌组织标本中，Hepsin、Maspin两种蛋白的表达与病理分级有统计学意义(P<0. 05)。随着宫颈鳞癌病理分级的增高Hepsin的表达增强，而Maspin的表达降低或缺失。详见表10。

        3讨论
        肿瘤的发生是多因素、多基因、多阶段协同作用的结果，几乎在所有肿瘤的发生和发展过程中都有癌基因的过表达和／或抑癌基因的表达缺失。宫颈癌居我国女性生殖系恶性肿瘤的首位，严重威胁广大妇女的健康，因此对hepsin、maspm在子宫颈癌中的表达和意义进行更深入的研究，对临床有一定的指导意义， 
        3.1 hepsin
        hepsin基因位于人染色体19qll - q13.2上，Leytus等克隆确定。Hepsin蛋白属于一种Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶，在细胞外的基质降解中可能发挥重要作用。hepsin在许多肿瘤如卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌等癌细胞中超表达。近的研究说明hepsin表达水平也可以作为前列腺癌超前诊断的一个重要标记物。 hepsin基因如何调控肿瘤转移的机制尚不清楚。近有学者认为hepsin通过活化的双链肝细胞生长因子( HGF)导致基底膜降解、细胞之间的黏附消失以促进肿瘤的侵袭和转移。
        目前有许多研究提出hepsin通过HGF/Met信号传导通路促进肿瘤的发生和进展，能够促进癌细胞的生长、浸润与转移。目前有很多研究提出hepsin可以通过裂解前体尿激酶型纤溶酶原激活物（pro - uPA）的蛋白质分解路径，导致基底膜降解，促进癌组织的浸润和转移。Aimes等[16]研究提示hepsin在新生血管的形成中发挥作用。因此hepsin可能通过多种途径促进癌组织的浸润、侵袭和转移。 hepsin在宫颈癌细胞中的研究目前国内外报道较步，本研究结果提示hepsin的异常表达与宫颈癌的发生发展呈正相关关系，可能扮演癌基因的角色，取官颈组织行hepsin监测可以帮助诊断宫颈癌，也可用于宫颈癌放化疗前后的对比，对病情及预后判断有一定的参考价值。 
        3.2 maspin
        maspin基因是1994年Zou Z等发现的，证实其为丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。maspin主要以可溶形式存在于细胞浆，也可定位于细胞表面或细胞核内。尽管maspln在正常组织和一些原位癌也有表达，但是随着肿瘤的侵袭和转移，表达逐渐消失。研究发现用质粒或反转录病毒转染乳腺肿瘤细胞使其maspin表达上调后，肿瘤的生长和转移被明显抑制，maspin阳性的肿瘤细胞其穿过基底膜的能力明显低于maspin阴性表达的肿瘤细胞。 maspin已经为恶性肿瘤的诊断和治疗提供了一种新的有效途径。有学者尝试将maspin作为肿瘤基因标记物，用于肿瘤预后判断、复发转移的监测、肿瘤亚型鉴别及化疗效果监测，其效果还在进一步的研究总结中。以maspin为靶点的抗肿瘤基因治疗也必将受到越来越多的关注。
         maspin作为一种抑癌基因有抑制官颈癌发生发展的作用，可望成为临床早期预测官颈癌及进行预防性化疗的新的参考指标，同时也可以作为判断宫颈癌转移潜能和恶性程度，评估患者预后的参考指标，可能成为从基因水平治疗的新靶点，还可避免化疗中毒。 maspin在官颈癌细胞中的研究目前是一热门，本研究结果显示maspin的异常表达与宫颈癌的发生发展呈负相关关系，对宫颈癌的发生发展可能起抑制作用，可能扮演抑癌基因的角色。 
        3.3 Hepsin与Maspin
        丝氨酸蛋白酶类是大且高度保守的蛋白水解酶家族。而Hepsin和Maspin均为丝氨酸蛋白酶家族，Hepsin是一种Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶，Maspin是一种丝氨酸蛋白酶抑制因子，两者结构特点有相似之处。徐勇等研究显示Hepsin在前列腺癌中表达上调，而Maspin的表达下调，与本研究结果相同。hepsin/Hepsin在官颈癌中的表达上调和maspin/Maspin的表达下调，在官颈癌的发生和发展过程中有重要的作用，hepsin/Hepsin和maspin/Maspin之间的不平衡发展可能导致官颈癌的友生，并且其表达水平与宫颈癌的预后密切相关。我们认为联合检测hepsin/Hepsin和maspin/Maspin的表达水平有助于官颈癌的诊断和判断预后，它们有可能成为一对新的官颈癌标记物。