二氢青蒿素对胃癌细胞血管生成及相关基因表达的影响

        胃癌是我国发病卒较高的恶性肿瘤之一，且易发生远处转移。肿瘤细胞增殖和远处转移均依赖于血管生成提供营养，而肿瘤细胞分泌的多种血管生成因子如VEGF-C、COX-2等在血管新生过程中发挥极其罩要的作用。二氢青篙素( clihvclroartemisinin，DHA)是青篙素类药物在体内的主要活性代谢产物，具有较强的抗肿瘤作用。有报道称，青蒿素通过抑 制VEGF从而抑制肿瘤淋巴管生成，DHA能抑制胰腺癌细胞中血管生成怛：。本研究利用人胃癌细胞株SGC7901，观察DHA对S(;C7901细胞血管生成及相关基因表达的影响及意义，为DHA的临床抗肿瘤应用提供依据。

        1 材料与方法

        I.I材料
        试剂与仪器RPMI 1640、胰蛋白酶、胎牛血清均为美I司CJibco公司产品；胰蛋白酶、二甲亚砜、3-(4，5一二甲基噻唑)一2，5--苯基氮唑溴盐(MTT)购白美国Sigma公司；二氢青篙素(批号：100184-200402)购于中圉生物药品检定所；VEGF-C、COX-2、VCAM-I、PTEN和GAPDH -抗购白美圈Santa Cruz金司；TRIzol试剂为美圉invitrogen公司产品；逆转录i蛴0盒购白Promega公司；Real-Time PCR试剂盒购白加拿大FermenLas公司；引物南【：海生T生物技术公司合成。Real-Time PCR仪购白美国ABI公司；电泳和转膜系统购白Bio-Racl公司。

        1.2方法
        1.2.1 细胞株培养和实验分组 胃癌细胞SC.C7901购白中国科学院海细胞生物研究所。SC.C7901细胞接种于含10%胎牛rfn清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，于37。C、5%CO：的培养箱中培养，80%汇合后胰蛋白酶消化法传代培养，于传代后第2天换液。

        1.2.2 MTT分析96孔板接种5×104/_fL SCC7901细胞，培养24 h后，5、10、20、40、80 pdmol/L DHA处理细胞24、48、72 h。以含0.1% DMSO的培养基为阴性对照组。取其中1个96孔板加入20 IiL/fL新鲜配制的MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4h，小心吸去培养液，加入150 IiL/+L DMSO，室温振荡10 min，于酶标仪490 mn波长测OD值。另取96孔板分别加入5、10、20，40、80 pdmol/L的DHA，每组6个复孔，分别继续培养24、48、72 h，结束前4h加入20 VL/+L新鲜配制的MTT，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)，37 0C继续孵育4h，小心吸去培养液，加入150 pdL/孔DMSO，室温振荡10 niin，于酶标仪490 mn波长检测代表细胞的增殖活 性（OD值）。 
        1.2.3 总RNA提取及荧光定量RT-PCR 80%汇合后的SGC7901细胞经胰蛋白酶消化法传代，培养24 h后，5、10、20、40、80 pdmol/L DHA刺激细胞24 h，或50¨mol/L DHA刺激细胞24、48、72 h，以含0.1%DMSO的培养基为阴性对照组。各组细胞总RNA采用TRIzol试剂按照说明书进行提取，经核酸定量分析仪测定浓度和纯度后，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性后用于反转录和荧光定量RT-PCR实验。取2 pdg总的RNA在25 pdL体系中逆转成cDNA，根据M-MLV逆转录试剂盒说明书操作。荧光定量RT-PCR反应如下：950C 4 min，进行35个循环。条件为：950C 30 s，600C 30 s，720C 30 s；后720C 5 min。使用的序列（表1）。所右反应均设3个平行组，实验结束后，每对引物的扩增产物均进行溶解曲线分析及相对表达量的计算。实验重复3次。

        1.2.4 Weslern blol检测80%汇合后的SC.C7901细胞经胰蛋白酶消化法传代，培养24 h后，5、10、20、40、80 pdmol/L DHA处理细胞24 h，或50 pdmol/L DHA处理细胞24、48和72 h，以含0.1% DMSO的培养基为阴性对照组。收集细胞，并将细胞用预冷的PBS洗涤2遍，用含RIPA的裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每泳道40 pdg样，10% SDS-PAC.E电泳，转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2h，TBST洗膜后加入特异性-抗(稀释比例为1：500 -1:1 000)，40C过夜。洗膜后加入1：5 000的HRP标址的相应二抗37 0C孵育，洗膜后ECL发光剂屁色、曝光、湿影、定影。实验取复3次。

        1.3绕计学分析 
        计数数据以戈±s表示，采用SPSS 13.0软件进行ANOVA分析处理和Dunnelt检验。P<0.05为差异有统计学意义。

        2 结果
        2.1 DHA对细胞活力的影响
        通过MTT实验测定DHA对细胞的活力的影响，结果湿示，与含0.1% DMSO对照组比较，各浓度DHA对细胞活力均有明屁的抑制作用，细胞活力随着DHA浓度的增加及作用时问延长而降低，组问差异有统计学意义(P<0.05)。由此衷明，DHA显著抑制细胞生长，且抑制效应呈剂量和时间依赖性（图1）。 　　

        2.2 DHA对胃癌细胞m管生成相关因子mRNA表达的影响 荧光定量RT-PCR的结果屁示，与含0.1% DMSO对照组比较，40¨mol/L DHA作用细胞48 h，VECF-C、COX-2和VCAM-1 mRNA表达明屁下调(P<0.05)，PTEN mRNA表达明屁升高(P<0.05)，组问差异有统计学意义（P<0.05，图2）。

        2.3 DHA对胃癌细胞m管生成相关因子蛋白表达的影响
        Weslern blol分析的结果屁示，与含0.1% DMSO对组比较，40¨mol/L DHA作用细胞48 h，VEC.F-C、COX-2和VCAM-1蛋白表达明降低(P<0.05)，PTEN蛋白表达明湿升高(P<0.05)，组问差异有统计学意义（P<0.05，图3）。

        3 讨论
        肿瘤所在的微环境是除了肿瘤白身因素外决定肿瘤发生发展的晕要因素，尤其肿瘤周围微血管的生成是肿瘤发生发展转移的关键因素，写预后密切相关，而肿瘤血管的生成又会受到血管生成促进因子和血管生成抑制因子双方面的调节。血管生成促进因子增多和（或）血管生成抑制因子减少，均可导致血管生成过程的启动。 由于中药作用丁肿瘤具有多靶点调节的优势，且日前许多化疗药物在治疗过程中不良反应大，治疗效果不理想，因此，在植物中寻找低毒高效的抗肿瘤药物已成为日前国内外重要的研究课题。二氢青篙素是青篙素类药物在体内主要活性代谢产物，且呈现…比其他青篙素类药物更强的抗肿瘤活性。近年来发现，DHA能抑制如胰腺癌、前列腺癌：41和肺癌等多种肿瘤细胞生长，具有较好的应用前景。

        本实验中使用6.25 - 100 limol/L的DHA作用细胞，以剂量和时间依赖的方式抑制细胞增殖。在此基础上，进一步从分子角度探讨了DHA对肿瘤血管生成因子表达的影响，结果湿尔DHA能以剂量和时间依赖性抑制SGC7901细胞中VEGF-C、COX-2和VCAM-I的转录和翻译，同时对PTEN的转录和翻译则有明艟的促进作用。VEGF是日前已知的作用强的促血管生成因子，能够特异地促进内皮细胞增殖、迁移以及肿瘤血管生成。61。多种肿瘤组织中VEGF表达上调，且其表达上调与血簪生成密切相关。

        国内研究人员发现，中药能抑制VEGF的表达，如雷公藤内酯醇、胃安宁颗粒及健脾解毒方都能通过抑制胃癌细胞或胃癌组织中VEGF表达发挥抗肿瘤作用[7-9]，本研究发现DHA也具有较强的抑制胃癌细胞VE(;F表达的作用，因此推测DHA也可能通过抑制VEGF表达从而抑制胃癌组织血管生成，后续体内实验将进一步明确这一结果。 环氧合酶( cyc:looxygenase，COX)是前列腺素( PCJs)合成过程中的一个晕要限速酶，已经明确，COX-2具有明娃的促进肿瘤血管生成的作用。有研究发现，COX-2和VCAM-I在胃癌组织中表达较高，与VEGF变化一致，且同时伴MVD升高；PTEN在胃癌组织中表达较低，与VEGF变化相反。

        本研究结果艟永，DHA也能抑制胃癌细胞COX-2和VCAM-I的表达，促进PTEN表达。 综上所述，中药DHA能通过影响不同类型肿瘤血管生成相关基因的表达，以多靶点、多角度的方式抑制胃癌细胞的生长。本研究为临床上以中药治疗或者辅助治疗胃癌提供了有力的证据，但南于基础研究与体内药物作用有所差异，相关体内研究机制探讨将在后续实验中得到印证。