验孕试纸改造一下就可以检测新冠病毒，便携、成本低、无需仪器！
文章来源：贤集网发布日期：2022-02-17浏览次数：2477 正值春运返乡大潮，核酸检测成了热词，没有被捅过鼻子或喉咙的人生是不完整的。在过去的一年里，阴性核酸检测报告在普通人的工作、生活里频频亮相，在很多时候成为返乡、出差、看病、出行等必不可少的通行证。在疫情防控的背景下，核酸检测是我们确定是否感染新冠病毒有效的手段。我们所说的核酸检测是基于RT-PCR技术检测SARSCOV-2(新冠病毒)的方法，准确率非常高，但需要复杂的仪器和熟练的技术人员，且耗时较长。疫情突发时，医护人员经常彻夜不眠采集样本，就是为了以快的时间准确、高效地锁定病毒感染者。现场即时检测（point-of-care testing，POCT）是在采样现场进行的、利用便携式设备及配套试剂快速得到检测结果的新方法，具有便携、成本低、上样量少等优点，对于传染病和人类疾病的快速诊断尤为重要。验孕试纸(pregnancy test strip,PTS)是一种侧向层析试纸条，通过检测尿液中hCG（人绒毛膜促性腺激素）的浓度，来判断妇女是否怀孕。验孕试纸工作原理示意图可以通过重新设计验孕试纸(PTS)以达到检测其他物质的目的，比如DNA和RNA，其核心在与将目标物的存在转化为hCG的产生，目前已经取得了许多进展，但也存在着诸如信号稳定性和操作灵活性差、检测灵敏度低、检测目标局限性大等问题。中科院长春应化所李冰凌研究员、杜衍研究员及其团队提出了一种基于CLIPON的方法，集成了核酸-hCG联合探针(NHP)、CRISPR-Cas12a、CRISPR RNA（crRNA）和大尺寸DNA组装体（CLD）等四大要素，为上述问题提供了全面的解决方案，并应用于检测人乳头瘤病毒(HPV)DNA、SARS-CoV-2冠状病毒基因组RNA和腺苷（非核酸目标物）等。研究内容以CLIPON:A CRISPR-Enabled Strategy that Turns Commercial Pregnancy Test Strips into General Point-of-Need Test Devices为题发表在《ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION》【技术路线和检测原理】图1.CLIPON：以双链DNA作为检测目标物的检测原理图示crRNA与部分DNA靶标互补使得crRNA/CRISPR-Cas12a复合物能够特异性识别感兴趣的靶标；crRNA/CRISPR-Cas12a复合物与DNA靶标的结合会激活Cas12a的非特异性DNA切割活性。激活的Cas12a随后切割NHP的DNA tag；后，经过设计的大尺寸DNA组装体能够与NHP内的DNA tag结合，从而阻止NHP在PTS上迁移；通过靶向诱导切割去除DNA tag后，NHP的hCG成分就不能与CLD结合，因此NHP可以在层析试纸上迁移，从而产生信号；因而，当含有DNA目标物时，PTS上同时出现一条检测线和一条对照线，而当不含DNA目标物时，则只出现一条对照线，这就实现了对目标信号的检测。基于CLIPON的策略有两大优势:首先,使用CRISPR-Cas12a介导的DNA识别来激活CRISPR的反式DNA切割活性，提供了更高的识别特异性和酶促转换来放大识别事件。其次，以往的方法只能直接检测ss核酸靶点，而CLIPON可以检测ss（单链）和ds（双链）两种形式的核酸，因此可用于大部分生物DNA的检测。第三，NHP中的DNA tag完全独立于待检测目标，单个NHP可用于检测任何感兴趣的目标。第四，CLD直接由环介导的等温扩增(LAMP)制备，这是一种简单、经济、广泛使用的核酸扩增技术。【CLIPON的检测效果】图2.使用双链DNA tag目标物验证CLIPON文中通过琼脂糖凝胶电泳证实了CLD对NHP的捕获能力。将CLD与NHP混合确实阻止了NHP在PTS上的迁移（图2b），与单独使用NHP时的强测试线相比，CLD和NHP混合后测试线消失。此外，NHP和CLD都可以冷冻干燥长期储存，冻干后的材料与新制备的材料表现出类似的性能。检测不含目标物的样本时不出现测试线，目标物dsDNA-T1浓度为50 pM出现可见测试线，这说明在不进行信号放大的情况下，CLIPON可以实现50 pM的检测限（LOD）。而随着dsDNA-T1的浓度逐渐增加，测试线的颜色也增强。研究人员还开发了一款名为“CLIPON image indicator”的手机app，用于量化PTS的颜色强度。还设计了一款手持式微流控芯片，以进一步简化现场测试。结合高效的重组酶聚合酶扩增（RPA）反应可以进一步提高检出限，RPA-CLIPON的工作机制如图3a所示。图3.RPA-CLIPON：将CLIPON与重组酶聚合酶扩增（RPA）偶联，以高灵敏度检测DNA基因组研究人员接着对HPV患者的分泌物进行检测，结果表明，RPA-CLIPON能够从临床样本中检测HPV-16。针对SARS-CoV-2 RNA基因组的检测表明，所设计的RPA-CLIPON-SARS-CoV-2体系能够在低水平（20 copies/μL）下特异性地检测dsDNA-SARS-CoV-2。由于很难获得真实的SARS-CoV-2样本，实验选择了具有相同病毒结构但无传染性的假病毒，结果表明RPA-CLIPON能够检测1000copy/mL(相当于1.6aM)的RNA-SARS-CoV-2，灵敏度能够满足2019冠状病毒的临床检测需求。RPA-CLIPON也可用于检测非核酸目标物（50μM的腺苷），随着腺苷浓度的增加，测试线越来越强。图4.RPA-CLIPON检测RNA-SARS-CoV-2(与新冠相同的病毒结构但无传染性)【结论】文中合理设计整合了含验孕试纸(PTS)、CRISPR-Cas12a、大尺寸DNA组装物的CLIPON生物传感平台，提供了快速检测的新途径，可对DNA、RNA和非核酸目标进行检测。还搭配了手机App和便携式微流控芯片，使得CLIPON测试平台高度自动化，方便快捷。能够检测HPV DNA和SARS-CoV-2 RNA，检出限低至~aM LOD，单次检测成本3-7美元。目前还需要对上游样品和处理过程进行进一步的优化，以实现真正的便携式，满足现场即时检测（POCT）的需求。 
