PROTAC靶向蛋白质降解剂：过去只是序幕，好戏才刚刚开始

▉ 摘要

靶向蛋白降解(TPD)是一种新兴的治疗方式，有可能解决传统小分子靶向治疗一直以来极具挑战性的致病蛋白质。随着 PROTAC 分子针对 2020 年提供的两个的癌症靶点的临床概念验证，该领域有望突破以前被认为是“不可用药”的靶点。

在这篇综述中回顾了PROTAC二十年的发现史，并评估了当前的形势；讨论了TPD未来的关键领域，包括建立TPD适合的靶类，扩大泛素连接酶的使用以实现医学，以及将该模式扩展到肿瘤学之外。

靶向蛋白质降解的发展历程

靶向蛋白质降解(TPD)因其潜在的治疗调节作用而引起人们的极大兴趣，而这些蛋白质已被证明难以用传统的小分子作为靶点。这些靶点中的许多在癌症和其他疾病中起着关键作用，因此尽管它们对小分子抑制剂响应不好，但仍然具有极大的治疗兴趣。

蛋白质水解靶向嵌合体(PROTAC)蛋白质降解物是一类主要的分子，它们可以通过TPD调节这些蛋白质。它们是由两个配体通过接头连接而成的异质双功能小分子：一个配体招募并结合蛋白(POI)，而另一个配体招募并结合E3泛素连接酶。PROTAC同时与POI和连接酶结合，诱导POI的泛素化，并随后被泛素-蛋白酶体系统(UPS)降解，之后PROTAC被循环以靶向POI的另一个副本。正是这种催化型作用机制(MOA)和事件驱动的药理学将PROTAC与经典抑制剂区分开来，经典抑制剂与POI有一对一的关系，其药理是由化学计量比驱动的，通常是通过与催化位点的相互作用来驱动的。

PROTAC 介导的靶向蛋白质降解的机制

PROTAC分子(在圆圈中放大)是连接泛素连接酶(蓝色)和目标蛋白(绿色)的异双功能分子。作为第一步，PROTAC诱导连接酶和底物的接近，这样泛素(粉红色)将通过连接酶的活性连接到招募的底物上。这是一个催化步骤，单个PROTAC分子可以反复执行，使泛素化反应能够多次转换，从而在底物上形成泛素链。泛素链随后被蛋白酶体识别(红色)，使泛素化底物穿梭于其蛋白水解室，并将目标蛋白降解成小肽(绿色)。

靶向蛋白质降解的两种基本模式

1. 关于TPD

泛素依赖的蛋白水解是降解细胞内蛋白的主要途径，在此途径中，蛋白质被蛋白酶体分泛素激活酶(E1)，泛素结合酶(E2)，后是泛素蛋白连接酶(E3)三步降解，它们协调泛素分子向靶蛋白(底物)的转移。

将这种自然降解系统用于治疗目的的概念受到了对病毒和植物的早期研究的启发，这些研究强调了设计小分子与E3连接酶结合并招募它们来降解POI的可能性。增选E3连接酶的初工作集中在两个研究领域。其中一项涉及使用连接酶招募配体来探测POI的生物学和表型，以此作为靶向抑制、基因敲除或基因敲除的替代方案。另一个领域探索了工程E3连接酶作为一种潜在的新的治疗方式，用于靶向那些被证明难以用常规小分子抑制剂药物治疗的蛋白质。

从技术上讲，这些早期的PROTAC现在被认为是“生物PROTAC”，因为它们不是完全的小分子结构，而是含有E3连接酶的肽配体。α肽的小分子模拟物的发现为完全基于小分子结构的PROTAC的合理设计打开了大门。随着这些早期PROTAC分子的发展，E3连接酶Cereblon(CRBN)被确定为沙利度胺及其类似物来那度胺和泊马度胺的靶点，这些药物在癌症治疗中被称为免疫调节性亚胺类药物(IMids)。这些药物联合CRBN针对IKAROS家族锌指1(IKZF1)和IKZF3降解，现在被认为是分子胶的先驱。

过去的二十年里，证明PROTACs和其他TPD分子具有广泛治疗潜力的证据已经从细胞裂解产物和细胞培养的研究转移到了动物和动物疾病模型的研究上。 目前，TPD分子已经从基于肽的分子发展到完全合成的、设计合理的小分子。人们认识到TPD作为一种治疗性小分子范型可能比靶向抑制和基因组靶向方法更具优势。 2.TPD的临床转化现状

合理设计的靶向蛋白质降解物作为潜在的人类疗法的时代始于2019年，这些新一代CRBN调节剂虽然不是双功能的，但在设计时考虑到了治疗靶点，化合物以分子胶合机制招募这些靶点，以使其降解。两种基本的TPD模式--一种是基于Celgene/BMS首创的IMIDS的发现和合理设计，另一种是基于E3连接酶招募者和Arvinas33-35首创的POI靶向弹头的合理配对的异型双功能PROTAC的概念化和开发，已经成为将TPD从替补席推向临床的催化剂。

3.降解剂的目标选择

新的CRBN调节剂建立在对沙利度胺类似物作用机制的基本理解基础上，沙利度胺类似物主要针对IKZF转录因子家族，可能还针对其他C2H2锌指转录因子，以及包含Gly-β-发夹环结构基序的蛋白质。相比之下，设计合理、功能各异的PROTAC降解器的建立始于考虑到特定的POI目标，这推动了这种TPD方法在不同的治疗目标和疾病适应症上的快速扩展。

4.PROTAC的临床概念验证

2020年前，有关异双功能降解物分子的四个关键问题仍未得到解答。它们会有类药特性吗？它们在人体内安全吗？它们会像预期的那样针对目标蛋白发挥作用吗？它们会有治疗效果吗？2020年，ARV-110和ARV-471第一阶段试验报告的初步阳性数据肯定地回答了所有四个基本问题-不仅是化合物本身，而且是整个TPD领域。鉴于这些发现对于TPD模式的重要性，我们在这里简要总结它们。

AR降解剂ARV-110在经大量预处理的转移性去势抵抗前列腺癌(MCRPC)患者中进行了评估。初步试验数据显示，ARV-110在剂量达420毫克时耐受性良好。这些数据还显示了ARV-110介导的肿瘤中蛋白质靶标的降解--这是在人类中发现PROTAC分子的证据--并揭示了抗肿瘤活性的早期迹象，通过前列腺特异抗原(PSA)或RECIST(实体肿瘤的反应评估标准)水平的降低来衡量。

ER降解剂ARV471作为ER+/HER2−局部晚期或转移性乳腺癌患者的单一疗法进入临床试验。ARV-471的中期数据显示了可管理的耐受性，临床疗效信号强劲，在经过大量预处理的人群中的临床受益率为42%，并且有证据表明，与FULVESTRANT和其他临床阶段选择性ER降解剂(SERD)相比，FULVESTRANT和其他临床阶段选择性ER降解剂(SERD)的ER降解率没有ARV-471高。到2021年底，至少有15种目标蛋白降解剂进入临床，其中包括异型双功能PROTAC和分子胶，预计还会有更多的降解物进入临床。

5.适合降解的目标

第一波临床阶段的蛋白质降解剂针对的是在疾病和容易获得的化学物质中具有临床验证作用的经典药物靶标。针对这些靶点的成功已经开始巩固PROTACs作为一种治疗手段，并强调了这些分子通过降解而不是抑制靶点而成为同类佳药物的潜力。到目前为止，传统的针对细胞内靶点的小分子药物发现研究往往集中在开发高亲和力的抑制剂，这些抑制剂要么针对酶的活性位点，要么针对酶上的变构位点，以关闭POI的功能。PROTAC治疗的佳靶点有几个共同的特征，包括：通过过度表达、突变、聚集、异构体表达或定位改变自然状态，从而导致致病功能的获得；E3连接酶可接近的结合表面；理想情况下，非结构化区域可与蛋白酶体结合。

早期的PROTAC目标集中在具有现有配体的POI上，这些配体以可用的抑制剂的形式存在。现有配体未能使患者充分受益的原因有几个，如不完全抑制、治疗窗口狭窄和部分选择性。通过将配体引入PROTAC中，PROTAC通常通过结合和促进其连接酶和POI靶标之间的相互作用而以迭代或“伪催化”的方式起作用，POI可以在不需要大量过量药物的情况下被降解，从而导致更完全的靶向阻断和更广泛的治疗窗口。配体结合位点的选择在支架蛋白的情况下尤其重要，在支架蛋白中，POI可能只在给定的复合物中部分暴露，通过靶向蛋白质复合体中的相邻蛋白质(旁观者效应)来降解POI也是可能的。

理想的E3连接酶配基将是一种强有力的结合剂，而且脱落率很低。共价结合POI的PROTAC失去了翻转和迭代作用的能力，而共价结合E3连接酶的PROTAC会将三体组装动力学降低为两体问题，并提高催化效率。目前选择性地与蛋白质共价结合的方法有限，但生物正交化学的进步可能产生具有更高催化效率和更持久的PROTAC。

总体而言，了解靶点的PROTAC能力是关键，特别是当新兴的和已经验证的靶点被认为是经典的小分子抑制或靶向蛋白降解作为一种治疗方式时。

6.扩展连接酶领域

近发现，ARV-110和ARV-471都使用CRBN作为E3连接酶，与其各自的靶标AR和ER结合，催化其泛素化和蛋白酶体降解。结合已有的CRBN调节剂，CRBN似乎正在成为临床试验中第一波TPD疗法的E3连接酶。但是，目前的问题不是基于E3连接酶的新的TPD疗法能否到达患者，而是何时发挥疗效以及针对哪些疾病？

降解物发现集中在两条主要途径上，用于发现导致特定靶标降解的分子。第一种方法中，一种特定的化合物被证明会导致目标的降解，导致回顾性地发现导致其降解的E3连接酶。另一条发现降解物的途径是由选择的治疗靶点合理驱动的，提供了通过使用针对POI的选择抑制剂和连接酶招募分子来根据POI定制连接酶的能力。

现阶段的TPD疗法可能会继续使用E3连接酶，VHL，CRBN和潜在的IAP连接酶在过去十年中已经被降解者评估和靶向。仅靠这几种连接酶，再加上可以转化为降解型弹头的经过临床验证的抑制剂，其覆盖范围就已经很大了。因此，在细胞培养实验和疾病动物模型中，使用VHL或CRBN作为招募连接酶，产生和表征一种新的降解物已成为惯例。

7. 探寻新的E3连接酶的必要

考虑到使用VHL、CRBN和其他具有已知配体的E3连接酶的PROTAC降解剂的工作效果，并且考虑到PROTAC概念的模块化性质，那我们就在思考，是否真的需要为TPD寻找和使用新的E3连接酶。尽管以VHL和CRBN为基础的PROTAC分子作为研究工具的产生已经成为常规，但它们的临床前和临床开发仍然面临挑战。特别是在肿瘤学中，对治疗药物的耐药性机制可能会迅速产生，肿瘤细胞可能会发生突变，以逃避依赖非必需连接酶的降解物。因此，新的E3连接酶对于应对各类临床挑战是非常有必要的。

环连接酶及其底物适配器

8.搜寻新的E3连接酶

E3连接酶的多样性和复杂性为TPD提出了两个关键问题：从哪里开始寻找新的连接酶，以及它们的哪些特性使其成为新的PROTAC开发的理想选择？一个实用和有价值的途径是寻求广泛适用的、无处不在的连接酶，类似于CRBN和VHL，可以与任何选择的靶点配对，并无限制地应用于许多不同的治疗适应症。

然而，对于给定的目标，VHL和CRBN的配对可能导致不同的降解效率，这是在PROTACs靶向融合癌基因BCR-ABL时观察到的。因此，有可能特定的一种连接酶比其他连接酶更能降解特定的靶标。在早期关于激酶可降解性研究的基础上，一项研究揭示了E3连接酶中的“可降解的激酶”和不同的激酶降解图谱，突显了连接酶选择在靶向降解激酶方面的重要性。不同的连接酶导致的降解图谱的差异可以由几个因素驱动，其一是连接酶与靶之间的形状互补性，第二个是连接酶在连接酶和POI之间形成具有降解能力的三元复合物的能力，第三个因素是连接酶和靶的不同亚细胞定位，第四个因素是连接酶和靶的特定细胞类型的表达谱。因此，除了上述连接酶(CRBN、VHL、MDM2、IAPs、DCAF15和DCAF16)外，已经证明PROTAC还可以利用另外几种‘通用’E3连接酶，使用专门招募连接酶来降解原型TPD底物BRD4的小分子共价工具。

9.靶向组织和细胞的E3连接酶

TPD新型E3连接酶的发现和开发需要涉及实际的考虑，例如连接酶的结构使能、可药性和机制的理解。例如，一种有效的底物是已知的吗？这种连接酶-底物关系能否在生化或基于细胞的结合分析的发展中被利用以实现筛选范例？连接酶是一直处于“开启状态”还是需要被生理刺激激活？一些连接酶处于“关闭”状态，在没有激活的翻译后修饰或存在结合配对的情况下会自动被抑制。增选这种自动抑制的连接酶可以在考虑降级发现时会带来额外的挑战。

到目前为止，已经鉴定了几种E3连接酶。连接酶具有组织特异性表达的明显的例子是骨骼肌中的海带样家族成员40(KLHL40)和KLHL41。还有一些E3连接酶在特定的组织或细胞类型中表现出一定程度的富集，尽管不是明确的特异性，例如糖特异性底物接头的非糖结合成员，F-box蛋白44(FBXO44)，它会在一些组织中富集。尽管缺乏明确的组织或细胞特异性表达，FBXO44和其他富含组织或细胞的连接酶仍然具有刺激TPD的潜力，因为它们的配体的亲和力可以被调节来调节对所选组织的特异性。

10.患病与健康组织和细胞中的E3连接酶富集

另一个探索pTPD的新领域是肿瘤细胞在邻近的非肿瘤组织上特异性靶向PROTAC分子，或者特定类型的肿瘤启动细胞摄取PROTAC分子，这可能是通过靶向肿瘤特异性或肿瘤富集的E3连接酶来实现的。这些相关性可以通过分析多个肿瘤细胞系的E3连接酶DepMap中的CERES分数来得出并显示出来。这使得对E3连接酶和其他UPS基因的鉴定成为可能。具有这些特征的连接酶的优点是肿瘤细胞对PROTAC产生基于连接酶的耐药性，这已经被证明发生在一些CRBN-和VHL-RecruitingPROTAC中。

与传统的多向毒性药物相比，识别、表征和开发PROTACs的肿瘤特异性E3连接酶，通过鉴定可以将其用于TPD的小分子，是潜在实现肿瘤特异性和更大治疗指数的一种方式。另一种方法是使用抗体-药物偶联物(ADC)的抗体介导的肿瘤特异性，即将降解物分子偶联到肿瘤特异性抗体上。这项技术近已经成为以肿瘤导向的方式输送PROTAC分子的一种令人兴奋的途径。Genentech的Dragovic等人已经推动了这一模式的发展，并成功地展示了两种不同癌症类型的肿瘤特异性靶向。

肿瘤学以外的治疗领域 1.炎症、免疫和肿瘤免疫学

BTK在炎症和肿瘤学上都是一个的靶点，临床上批准的药物已经成为学术界和工业界密集的PROTAC分子实验的对象，特别是C481S的出现使第一代BTK抑制剂的药效降低。这就是PROTAC的一大优势，PROTAC可以通过催化降解靶标来克服对这种耐药突变的不敏感性。

相比之下，虽然RAK4在炎症条件下以及B细胞淋巴瘤中的作用已经确立，但目前还没有批准的IRAK4靶向疗法。在这里，IRAK4潜在的支架作用还存在一些问题，因为它的激酶功能抑制剂可能不能完全解决IRAK4在这些条件下的作用。PROTAC降解剂的另一个优点是它们能够完全降解靶标，而不是仅仅抑制其酶功能，这不会影响靶标可能具有的任何支架作用。特别是对于IRAK4，它在肌体周围的Toll样受体(TLR)信号传递中的支架作用是建立在的基础上的，并且可能只有PROTAC降解物才能寻址，其中许多降解物到目前为止已经被描述。

2.抗病毒PROTACs

PROTAC也可能成为潜在的抗病毒药物。抗病毒PROTAC的可行性初是通过与CRBN连锁的丙型肝炎病毒抑制剂，在细胞分析中降解丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶而建立的，但随着导致新冠肺炎大流行的SARS-CoV-2病毒的出现而被推向前台。在SARSCoV-2感染细胞中进行的一项大型PPI研究揭示了几种潜在的可用药途径和蛋白，这些途径和蛋白可能被重新调整用途的抑制剂所利用，并可能被SARS-CoV-2靶向PROTAC分子所解决。

可替代的PROTAC模式 1.bioPROTACs和pepTACs

生物PROTAC类别可进一步分为三个亚类：双功能肽、融合蛋白和双特异性抗体模拟物。在生物PROTAC的三个亚类中，肽TAC与PROTAC关系密切，因为它们由与E3连接酶结合的肽和与POI结合的肽组成。两个肽弹头通常与肽链相连，N端或C端通常连接有细胞穿透肽。然而，由天然氨基酸组成的肽TAC可以省去CPP，通过转染DNA或mRNA转录本的细胞来原位合成降解物。

从那时起，其他研究组也报道了融合生物PROTAC能够降解癌症靶标HER2、MYC和KRAS，并在过表达这些POI的人类癌细胞株和小鼠异种移植瘤模型中显示了治疗相关效应。已报道的融合包括将E3连接酶的底物结合域，如Cbl原癌基因(CBL)、U-box-typeE3连接酶STIP1同源物和U-box-containingprotein 1、VHL、E6AP和HIV-1Vif，替换为POI的专一性结构域，或者在MYC的情况下，替换为MYC相关因子X，这是一种形成异源蛋白的小蛋白。

2.抗GFP bioPROTAC平台

另一种探索CRL家族嵌合E3连接酶降解效率和各自靶点的方法是通过用GFP结合域替换适配蛋白的天然底物识别结构域来构建生物PROTAC。该平台已被用于基于各种E3连接酶产生降解GFP的生物蛋白：CUL1连接酶β-TRCP、F-BOX和WD重复结构域包含7(FBW7)和Skp2；CUL2连接酶VHL；CUL3连接酶斑点型BTB/POZ蛋白(SPOP)；CUL5连接酶细胞因子信号转导抑制因子2(SOCS2)和锚蛋白重复和SoCS盒包含1(ASCS1)。该平台还可以将GFP降解结构转化为降解POI的生物PROTAC。此外，该平台还被应用于发现KRAS靶向的生物PROTAC。

3.基于寡核苷酸的PROTACs

转录因子和RNA结合蛋白是DNA修复、复制、转录和许多RNA依赖过程所必需的两类蛋白质。然而，当转录因子和限制性商业惯例发生突变时，会导致多种类型的癌症、肥胖以及心血管和神经疾病。尽管做了很多努力，这些POI在很大程度上仍然没有被下药，因为它们中的许多都缺乏配体结合位点。为了解决这些POI，靶向限制性商业惯例的RNA-PROTAC和靶向转录因子的寡核苷酸PROTAC(O‘PROTACs)和转录因子靶向嵌合体(TRAFTACs)已经被开发出来。

4.bioPROTACs的未来

在不久的将来，生物PROTAC将被用作工具分子来驱动小分子PROTAC药物的开发。与小分子PROTAC一样，如果弹头已知，可以快速组装生物PROTAC来识别有效的降解剂。对于尚未发现小分子配体或不存在有效的小分子结合位点的未用药靶标，生物PROTAC具有优势：未用药靶标通常形成传统药物难以阻断的PPI，但其蛋白结合域为组装生物PROTAC以启动药物发现过程提供了起点。

PROTAC技术将蛋白质降解器的功能带入靶点，这扩大了可触及的目标，远远超出那些可以通过传统的化学计量抑制来下药的目标，并提供了实现选择性的新方法。适合于通过靶向蛋白质降解而不是化学计量抑制进行治疗干预的蛋白质包括因突变、过度表达、聚集或蛋白质异构体的差异表达或定位而获得致病功能的蛋白质。从结构的角度来看，PROTAC靶需要一个小分子结合表面，这个表面可以被E3连接酶接近，并且理想的是有一个可以嵌入蛋白酶体的非结构化区域。

▉ 总结

鉴于过去20年的进展以及学术界和工业界近的兴趣和投资水平，很明显，靶向蛋白质降解可能成为一种关键的治疗方式。见证了它从耐人寻味的想法到临床验证的概念的转变，首先是通过IMIDS和分子胶，近是通过I期和II期临床试验中的异质双功能PROTAC。这些发现将在未来几十年进一步推进有针对性的蛋白质降解，同时也相信这种方式会为患者提供跨不同适应症的新治疗选择。