肠道微生物与肝胆肿瘤抗PD-1免疫治疗临床反应相关

背景：肠道微生物与不同类型癌症的免疫治疗反应有关。然而，肠道微生物对肝胆肿瘤免疫治疗的影响仍不清楚。本研究旨在探讨晚期肝胆肿瘤患者肠道微生物与抗PD-1免疫治疗临床反应的关系。

方法：从一线化疗进展到不能切除的肝细胞癌或晚期胆道癌患者被纳入研究。在抗PD-1治疗前和治疗期间收集粪便样本，并通过宏基因组测序进行分析。鉴别出差异富集类群和预后相关类群。进一步利用KEGG数据库和me[x]taCyc数据库对差异富集类群进行注释，探讨肠道微生物群影响肿瘤免疫治疗的潜在机制。

结果：本研究共纳入65例接受抗PD-1治疗的晚期肝胆肿瘤患者。74个分类群在临床获益组(CBR)富集，40个分类群在非临床获益组(NCB)富集。在这些分类群中，Lachnospiraceae bacterium-GAM79和Alistipes sp Marseille-P5997丰度较高的患者(在CBR组中富集)比丰度较低的患者获得更长的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。在PFS较长的患者中，CBR组富集的Ruminococcus calidus和Erysipelotichaceae bacterium-GAM147的丰度也较高。相反，Veillonellaceae丰度较高的患者PFS和OS较短，而NCB组中Veillonellaceae富集。

功能注释表明，CBR组的富集类群与能量代谢相关，而NCB组的富集类群与氨基酸代谢相关，这可能调节肝胆肿瘤免疫治疗的临床反应。此外，免疫治疗相关的不良反应也受到肠道微生物多样性和相对丰度的影响。

结论： 本研究证明肠道微生物群与肝胆肿瘤患者抗PD-1免疫治疗的临床反应相关。响应者的分类特征是预测免疫治疗的临床反应和生存获益的有效生物标志物，这可能为调节肿瘤免疫治疗反应提供新的治疗靶点。    

结果

1 患者特征

从2018年11月至2020年12月，共纳入162例晚期肝胆肿瘤患者，纳入65例患者(图1)。患者基线特征总结见表1。该研究包括30例HCC和35例BTC患者。所有患者均接受抗PD-1免疫治疗。按照RECIST V.1.1标准，PR(部分缓解)、SD(疾病稳定)、PD(疾病进展)分别有20例、28例、17例患者。

在CBR评估中，32例患者为CBR，33例患者为NCB。大约一半的患者有肝炎史，并在PD-1单抗药物治疗期间接受抗病毒预防治疗。所有患者肝功能及体能状态均良好；三分之一的患者胆汁酸升高。CBR组与NCB组在性别、年龄、肝炎史、胆红素、胆汁酸、肿瘤数量、肿瘤大小、肿瘤分期等方面无统计学差异。收集65例患者的基线粪便样本，8例患者(4例CBR和4例NCB)的持续动态样本。

BTC，胆道癌；CBR，临床获益；ECOG-PS，美国东部肿瘤协作组体能状态评分；HCC，肝细胞癌；NCB，非临床获益。   

2 肠道微生物组成与抗PD-1免疫治疗的不同临床反应相关

为了探讨肠道微生物组成与免疫治疗反应之间的关系，我们比较了CBR组和NCB组在不同系统发育水平上的相对丰度。总体而言，在门水平上，拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)在CBR组和NCB组的肠道微生物群落中均占主导地位，其次是放线菌门(Actinobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)(在线补充图S1)。CBR组的Bacteroidetes丰度更高(p=0.028)，NCB组的Proteobacteria丰度更高(p=0.067)。在目水平上观察到类似的组合模式。

CBR组中Bacteroidales(属于拟杆菌门)的相对丰度较高(p=0.028)，而NCB组中Enterobacterales(属于变形菌门)的相对丰度更高(p=0.061)(图2B)。Veillonellales主要在NCB组中发现(图2A)，其相对丰度在CBR组中降低(p<0.001)(图2B)。丰富的前20种物种主要属于拟杆菌门(在线补充图S2)，其中Alistipes sp Marseille-P5997、Bacteroides fluxus和Bacteroides zoogleoformans主要在CBR组中富集(p=0.024，p=0.012和p=0.031)(在线补充表S1)。

在统计学差异属或种中，CBR组富集的细菌类群大多属于拟杆菌门和厚壁菌门，而NCB组富集的细菌类群大多属于变形菌门(在线补充图S3和S4)。值得注意的是，Lachnospiraceae bacterium-GAM79和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)的几个分类群(Ruminococcus callidus、Eubacterium siraeum、Gemmiger formicilis和Faecalibacterium)在CBR组中富集。此外，对8例患者的动态粪便样本进行宏基因组分析发现，CBR组的肠道微生物组成在门水平上随治疗保持相对稳定，与65例患者的肠道微生物组成相似。而NCB组的微生物多样性似乎有所下降。

总之，基线肠道微生物多样性与肝胆肿瘤患者抗PD-1治疗的良好反应相关，这支持肠道微生物可能是预测免疫治疗反应的有效生物标志物。

3 差异富集的细菌类群与ICI治疗的生存获益相关 

系统发育多样性方面，α多样性(包括Shannon指数、Simpson指数、Pielou指数和Chao1指数)在CBR组和NCB组之间没有差异(在线补充)。然而，基于Bray-Curtis距离评估的β多样性，PCoA图显示CBR组患者与NCB组患者明显分离。在种水平上，CBR组和NCB组共有1738种常见物种，分别有504和575种特有种。

通过LEfSe分析进一步确定74个CBR组富集类群和40个NCB组富集类群可能影响ICI治疗的临床反应(LDA＞2，p＜0.05)(在线补充)。值得注意的是，拟杆菌门(Bacteroidetes)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、拟杆菌目(Bacteroidales)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)是CBR组中的高富集类群，而Negativicutes、韦荣球菌目(Veillonellales)和韦荣球菌科(Veillonellaceae)是NCB组中的高富集类群(LDA＞3，p＜0.05)。

在HCC或BTC患者的亚组分析中观察到类似的差异富集模式。HCC患者和BTC患者间微生物α多样性和β多样性没有差异(在线补充)。两种癌症类型之间存在差异的细菌类群主要属于拟杆菌门(在线补充)，BTC患者的拟杆菌门丰度高于HCC患者(LDA＞3，p＜0.05)(在线补充)，BTC患者的CBR组中也富集拟杆菌门(在线补充图S9A，B)。对于HCC患者，NCB组也观察到韦荣球菌科(厚壁菌门)的丰度更高(LDA＞3，p＜0.05)(在线补充)。

为了进一步探索与生存期相关的微生物类群，基于CBR组和NCB组中这些差异富集类群的平均丰度，我们将65例肝胆肿瘤患者分为高丰度组和低丰度组。生存分析显示，Lachnospiraceae bacterium-GAM79丰度较高的患者比丰度较低的患者具有更长的PFS(mPFS:7.9个月vs 5.1个月，p=0.020)和OS(mOS:NRvs 13.8个月，p=0.023)。Lachnospiraceae bacterium-GAM79和Ruminococcus callidus的富集也与更长的PFS相关(mPFS:10.8个月vs 4.9个月，p=0.009；mPFS:22.1个月vs 5.5个月，p=0.006)(在线补充)。考虑到丰富的类群，拟杆菌门(Bacteroidetes)，尽管只有较高丰度的拟杆菌目显示出与良好预后相关的趋势(mPFS:6.9个月vs 5.1个月，p=0.250；mOS:32.2个月vs 13.8个月，p=0.269)(在线补充D)，Alistipes sp. marseile-p5997丰度较高的患者PFS(mPFS: 9.0个月vs 5.2个月，p=0.013)和OS(mOS:NR vs 13.8个月，p=0.021)延长，而Bacteroides zoogleoformans的富集也与较长的PFS呈正相关(mPFS:8.1个月vs 5.2个月，p=0.043)(在线补充)。