CAR-T细胞疗法中如何克服T细胞耗竭？

近年来，以嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）为代表的免疫疗法在癌症治疗方面取得了巨大的临床进步。然而， T细胞耗竭（T cell exhaustion）会严重影响癌症免疫疗法的治疗效果，这制约着新型细胞疗法的进一步发展。 T细胞耗竭是一种功能减退的状态，其特征在于T细胞效应功能和自我更新能力的逐渐丧失。 

CAR-T细胞耗竭的证据

CAR-T细胞治疗后的疾病复发仍然是现阶段CAR-T免疫疗法的一个主要挑战，这促使学者们去探索CAR-T细胞耗竭在肿瘤逃逸中的潜在作用。与内源性肿瘤反应性T细胞相比，CAR-T细胞以其基因修饰为标志，更有利于追踪和评估肿瘤靶向细胞。此外，下一代CAR-T细胞疗法可以进一步对CAR-T细胞进行基因编辑，以减轻或中断细胞耗竭。这些因素促使学者们去研究T细胞耗竭过程中的临床相关背景和重要模型。 

临床前体内模型对于理解CAR-T细胞耗竭程序至关重要。在黑色素瘤的小鼠模型中，肿瘤浸润性CAR-T细胞具有PD-1+TIM3high表型，与衰竭TOX和TOX2以及NR4A1、NR4A2和NR4A3的典型转录因子的表达增加相关。

同样，慢性抗原诱导的信号和组成性的、低水平的、基础的信号都会导致CAR-T细胞耗竭。这些临床前的发现表明CAR-T细胞具有耗竭特征的表型、转录和表观遗传特征。 

临床上，对治疗中或复发后活检样本的分析将有助于确定CAR-T细胞耗竭导致患者疾病控制丧失的程度。有学者向B-ALL病人体内输注 CD19靶向、基于4-1BB的CAR-T细胞，在4周后获取到了耗竭相关的DNA甲基化特征。另一项研究表明，输注后几个月，慢性淋巴细胞白血病患者的血液中持续存在TIM3+PD-1+ CAR-T细胞，这些细胞在临床结果较差的患者中富集。尽管在这两项研究中对循环耗竭的CAR-T细胞进行了全面的描述，但肿瘤微环境（TME）中 CAR-T细胞耗竭的数据相对缺乏，而TME通常是细胞耗竭突出的地方。 

在接受抗CD19 CAR-T细胞注射的51例大B细胞淋巴瘤（LBCL）患者的肿瘤免疫环境研究中，研究者报告了循环CAR-T细胞峰值水平 (对应持久疗效) 与TME中耗竭的CD8+ T细胞的丰度之间存在负相关。然而，该评估没有区分耗尽的CD8+ T细胞是CAR-T细胞还是内源性未修饰的T细胞。注入的CAR-T细胞缺乏持久性可能会限制对其耗竭的评估。 虽然表征输注后CAR-T细胞的临床报告数量较少，但关于生产后和输注前体外CAR-T细胞表型的文献相对较多。低分化细胞比例较高的产品，如CD45RA+CCR7+ CAR-T细胞，与多种血液恶性肿瘤的预后改善相关。

此外，具有较高水平抑制性受体 (如PD-1和LAG3) 的CAR-T细胞产物在输注后扩增较少，并与慢性淋巴细胞白血病、儿童和年轻成人CD19+白血病或LBCL患者的较低应答率相关。虽然T细胞在刺激后5-8天表现出耗竭的表观遗传特征，但共抑制受体也在高功能、活化的T细胞上表达。因此，这些预输注数据强调了两个要点：(1) 除耗竭之外的其他细胞状态，包括效应子和记忆分化，可以解释T细胞的功能和持久性；(2) 仅基于共抑制受体的表达很难评估T细胞耗竭。

阻断CAR-T细胞耗竭

输注前和输注后的CAR-T细胞表型与来自临床前体内模型的数据表明了CAR-T细胞耗竭在临床结果上的限制作用。如果CAR-T细胞确实因耗竭而受损，那么中断这种功能低下的细胞状态就会提高疾病的治疗效果。CAR-T细胞耗竭程序的中断也许可以通过废除典型的TOX和NR4A转录因子或抗体介导的共抑制受体如PD-1的阻断来实现。 

不受控的NFAT信号导致耗竭相关T细胞转录因子NR4A和TOX的表达，从而加强了与耗竭相关的表观遗传和转录程序。删除Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3基因后则可以恢复功能和表观遗传程序，增强CAR-T细胞在实体瘤小鼠中的功效。类似地，具有短发夹RNA介导的Tox敲除的小鼠，其CAR-T细胞比Tox野生型细胞更持久且具有更强的治疗活性，特别是当Tox2基因缺陷时。有趣的是，其他研究表明，在患有肿瘤或慢性病毒感染小鼠中，Tox基因的缺失会导致凋亡增加和抗原特异性鼠T细胞的持久性受损。这种差异可以用Tox基因完全缺失的差异作用来解释，而shRNA介导的敲低则是使表达部分减少，而非完全缺失。

然而，综合这些结果，学者们担心T细胞内耗竭途径的分子中断可能会损害T细胞的适应性。 许多临床前研究和至少20个有效的临床试验都致力于通过阻断或消除PD-1信号传递以增强CAR-T细胞功能。他们通过多种方式实现CAR-T细胞中PD-1的功能性消除。其中直接的方法就是用抗PD-L1抗体对患者进行联合治疗。在CD19靶向的CAR-T细胞治疗后疾病复发的患者中，用这种抗体治疗会导致病人外周血中CAR-T细胞的重新扩增；然而临床上的疗效反应则很少，在12名患者中仅有1例完全缓解和3例部分缓解。在28名患者参与的一项更大规模的临床研究中，抗CD19 CAR-T细胞和早期PD-L1阻断被联合使用，来治疗大B细胞淋巴瘤患者。

临床结果显示，持久的应答率与单独使用CAR-T细胞治疗的结果相似，这表明联合免疫检查点抑制剂治疗没有额外的益处。 一项来自一期试验的数据显示，在18例恶性胸膜间皮瘤患者中，靶向间皮素的CAR-T细胞产品和抗PD-1抗体的组合具有良好的疗效 (中位和1年总生存期分别为23.9个月和83个月)；然而，有一部分间皮瘤患者也会对单独的抗PD-1治疗产生反应。 

上述研究表明对PD-1信号的阻断不足以从表观遗传学上重新逆转T细胞耗竭程序，而只能部分逆转耗竭的转录表型。因此，在CAR-T细胞输注后，共抑制性受体阻断发生在早期 (当它能阻断低分化效应子中的抑制信号时) 还是晚期 (耗竭发作后) 更有效尚不清楚。CAR-T细胞是否会形成前体耗竭状态仍然有待研究。 在抑制PD-1或其他共抑制受体信号传导的其他方法中，有一种方法是改造CAR-T细胞本身以分泌拮抗抗体。此外，PD-1显性失活受体 (DNRs) 的过表达或者对CAR-T细胞中PDCD1基因座进行基因编辑可以从本质上消除PD-1信号传导。每种方法都有潜在的优点和缺点。

例如，CAR-T细胞原位分泌抗PD-1抗体可能会限制全身性抗体暴露，从而降低毒性。T细胞内的基因编辑方法则可以有效地消除编辑细胞中的信号传导，但不会增强内源性T细胞回应。缺乏细胞内信号结构域的PD-1 DNR的过表达可以通过与内源性PD-1竞争与微环境PD-L1的结合来减轻修饰T细胞中的抑制性信号传导。这些方法都被证明可以增强CAR-T细胞在各种血液和实体肿瘤中的临床前抗肿瘤功效。 

目前正在进行的，将PD-1阻断纳入CAR-T细胞治疗的大量临床试验将会产生更明确的结论。此外，在针对接受CRISPR-Cas9工程改造T细胞治疗的三名患者的早期研究中也产生了激动人心的结果。学者们发现，在这些患者中，带有PD-1缺失的T细胞的持久性低于PD-1未缺失的T细胞。这一发现可能有与PD-1生物学无关的其他解释，如多重编辑的遗传毒性应激；然而，它与在小鼠研究中的观察结果相一致，在小鼠研究中，PDCD 1缺乏和抑制性PD-1信号的丧失导致对慢性病毒感染有反应的抗原特异性CD8+ T细胞的过度刺激，引起细胞死亡。因此，效应期共抑制受体的表达可能有助于抑制T细胞过度刺激，未来学者们需要进一步通过研究来阐明能保留T细胞持久性和功能性，同时又能将PD-1 消除的佳方法和时机。 

大量研究表明T细胞的耗竭是表观遗传固定的，并且普遍认为这些耗竭的后期阶段不太容易接受治疗干预，因此，针对T细胞分化途径的早期阶段的干预可能是提高抗肿瘤免疫的有效方法。改善细胞培养条件和优化CAR设计及下游信号传导的策略，提供了缓解 （而非阻断） 诱导T细胞耗竭程序的可能性，从而增强CAR-T细胞功能。

提高CAR-T细胞与肿瘤细胞的比率

耗竭并不是纯粹的T细胞内在过程，还可能取决于肿瘤和患者的特征。肿瘤微环境 (TME) 中的代谢和基质因子可以调节T细胞耗竭。另外，癌细胞的特征可以决定CAR-T细胞疗法的疗效。例如，白血病细胞中的死亡受体信号传导受损可以诱导CAR-T细胞耗竭。此外，已经有学者注意到CAR-T细胞活性的疾病特异性差异。例如，与血液恶性肿瘤相比，CAR-T细胞对实体瘤的细胞毒性依赖于IFN受体信号传导。 除了癌细胞的定性特征外，其定量特征也可能决定CAR-T细胞疗法的疗效。

CAR-T细胞治疗的临床获益与多种疾病的肿瘤负荷呈负相关，包括急性淋巴性白血病 （ALL） 和大B细胞淋巴瘤 （LBCL） 。这一发现的一个潜在解释是较高的抗原负荷导致持续的CAR刺激，从而导致CAR-T细胞耗竭，这进一步论证了在CAR-T细胞治疗前减少癌细胞数量作为限制CAR-T细胞耗竭手段的可能性。这种策略可以以手术、放疗、靶向治疗或化疗的形式出现。 另一方面，可以考虑增加注入的CAR-T细胞的数量。

一项涉及LBCL患者的临床研究显示，输入病人体内的CD8+ CAR-T细胞数量与持久应答概率之间存在相关性。此外，输注的CD8+ CAR-T细胞数量与治疗前肿瘤负荷之比与持久应答具有统计学相关性。 一项针对输注CAR-T细胞的儿童患者的回顾性研究发现，随着组织细胞药物剂量的增加，患者的无事件生存率、无复发生存率和总生存率均有所增加。

然而，考虑到既往治疗史和疾病状态可能是CAR-T细胞产量的混杂因素，学者们需要在前瞻性临床试验中解决更高的CAR-T细胞剂量是否有益的问题。 此外，使用CAR靶向抗原进行疫苗接种是目前在研的另一种可能增加体内CAR-T细胞数量的方法。除CAR-T细胞外，内源性T细胞应答也可能有助于提高抗肿瘤活性。总之，多项研究发现表明，增加效应T细胞与肿瘤负荷之比的策略是减轻T细胞耗竭和改善临床结果的有希望的途径。

优化T细胞培养条件

临床级CAR-T细胞产品的制造需要有优化的收集步骤和标准化的操作程序。大量的临床前研究工作致力于改进CAR-T产品的制造过程，并减少CAR-T细胞耗竭。 在小鼠B-ALL异种移植模型中，仅培养3天而不是9天 （现行标准为7-14天） 的CAR-T细胞即使以低六倍的剂量进行输注，仍能在小鼠体内显示出更大的扩张性、作用持久性以及更强大的肿瘤控制能力。数据显示，9天的CAR-T细胞分化程度较高，反而限制了它们自身的增殖能力和效应功能。学者推测，培养9天的CAR-T细胞被更多地消耗，这表明较短的培养时间可能会缓解T细胞耗竭。 改变培养物中的细胞因子组成也可能会缓解T细胞耗竭。

与标准的IL-2补充相比，在IL-15存在的情况下培养的CAR-T细胞减少了细胞耗竭标志物的表达，增强了抗凋亡特性，并增加了增殖能力。此外，在CAR-T细胞制造过程中，PI3K-AKT信号通路的抑制与在小鼠模型中CAR-T细胞更大的扩张性、持久性和抗肿瘤活性有关。从机制上讲，使用双重PI3Kδ/γ抑制剂会导致CAR-T细胞耗竭标志物TIM3