乳双歧杆菌Probio-M8通过调节肠道菌群改善绝经后骨质疏松症患者的骨代谢

骨质疏松症是一种常见的衰老相关疾病，其特征是骨流失和骨组织结构退化，它影响着全球超过2亿人，每年造成890万例骨折。此外，有超过30%的50岁以上妇女绝经后都患有骨质疏松症。许多因素会导致绝经后骨质疏松症(PMO)的发生和发展，如遗传易感性、生活方式和饮食，绝经和衰老相关的雌激素的缺失起着决定性的作用。骨组织通过骨吸收和骨形成的协同作用不断重塑，骨代谢的动力学由雌激素、PTH和VD共同调节。绝经后妇女的雌激素水平下降、PTH增加和肾脏内维生素D激活的减少可能导致循环和靶组织中的骨化三醇缺失，从而影响肠道对钙和磷酸盐的吸收，导致矿化稳态和骨吸收的失调。目前骨化三醇已被引入欧洲市场，特别是用于PMO和肾骨病。然而，PMO的治疗是一个长期的过程，长期服用药物可能会导致副作用，如便秘和高钙血症。因此，探索新的治疗途径以缓解现有方案的副作用是很有意义的。 肠道微生物群及其代谢物与人体健康密切相关，包括骨代谢。研究发现骨质疏松症老年患者的骨密度(BMD)降低很可能与肠道生态失调有关，提示肠道微生物群可能是治疗PMO的一个潜在靶点。益生菌的使用已被证明对骨代谢有良好的影响，但益生菌调节肠道微生物组/代谢组在改善骨代谢中的作用尚未得到阐明。乳双歧杆菌Probio-M8是从一名健康女性的母乳中分离出的一种新型益生菌。在先前的研究中，Probio-M8可以通过增加促进健康的肠道微生物的丰度来缓解神经退行性疾病和哮喘。因此，本研究作为一项初步研究，旨在探讨Probio-M8配合常规治疗(钙和骨化三醇)改善PMO患者骨代谢的作用和机制。

结果

1.联合给药Probio-M8可改善骨代谢和成骨细胞活性

在基线时，Probio-M8组和安慰剂组之间的所有监测参数都没有明显的差异；而在干预结束时，两组间血清中PCT、PTH、VD3和钙的浓度均有差异(表1)。在第3个月时，Probio-M8组(0.03 ± 0.01 ng/mL)较安慰剂组(0.04±0.01 ng/mL)PCT水平降低(P<0.01)；PTH水平(Probio-M8组：36.49±18.24 pg/L，安慰剂组：45.05±19.39 pg/L；P=0.039)和钙水平(Probio-M8组：2.27±0.12 mmol/L，安慰剂组：2.38±0.12 mmol/L；P=0.013)低于安慰剂组，而VD3水平则相反(Probio-M8组：26.22±7.90 ng/L，安慰剂组：20.52±7.07 ng/L；P=0.032)。纵向比较显示，两组在第3个月时ALP水平均下降，Probio-M8组中观察到OC降低。这些结果共同表明，Probio-M8与钙和骨化三醇联合给药比仅服用钙和骨化三醇更有利于骨代谢的改善。

2.联合给药Probio-M8并没有改变受试者的肠道微生物群多样性

在受试者肠道微生物群的α多样性中，未观察到明显的组内或组间差异(图2a)。同样，PCoA(Bray-Curtis距离)评分图也没有显示任何基于组内或组间的聚类(图2b)。结果表明，益生菌摄入没有引起受试者肠道微生物群多样性和结构的明显变化。

a Probio-M8组和安慰剂组分别在基线(0 M)和3个月干预(3 M)后的粪便微生物群的Shannon多样性指数。b 两组在不同时间点的主坐标分析(PCoA)评分图。c 两组在不同时间点反应性SGB的丰度比较。

3.联合给药Probio-M8增强了POM患者的肠道微生物群相互作用

我们构建了属水平的肠道微生物互作网络(图3)，相关强度定义为：非常强(|r|≥0.8)、强(0.6≤|r|<0.8)和中等(0.5≤|r|<0.6)。在基线时，总共检测到31个相关性(8个强正相关，16个中度正相关，7个中度负相关)。虽然两组的微生物互作在第3月时与基线相比都有所增加，但第3月时Probio-M8组明显更强，具有到76个相关性(1个非常强正相关，31个强正相关，15个中度正相关，12个强负相关，17个中度负相关；包括一些的产丁酸菌，如Ruminococcus、Butyricicoccus、Eubacterium)。相比之下，安慰剂组的相关网络关联性较低，只检测到39个相关性(3个非常强正相关，18个强正相关，4个中度正相关，1个非常强负相关，12个强负相关，1个中度负相关)。值得注意的是，Probio-M8组在第3个月时检测到双歧杆菌与Eubacterium、Blautia、Ruminococcus的正相关性进一步增强，而在安慰剂组没有。结果表明，Probio-M8联合给药增强了患者肠道微生物群互作的强度。

4.联合给药Probio-M8可调节肠道微生物群中编码的骨代谢相关功能

利用KEGG数据库对受试者肠道微生物群中编码的通路和功能进行了注释(图4)，共注释了6095个富集通路(KOs)。我们鉴定出22个反应性KOs，在基线时组间没有明显的差异，但在第3月时的丰度差异。有4个反应性KOs在安慰剂组比Probio-M8组明显更高(K00338、K03617、K18377、K03346，参与能量代谢和蛋白质家族：遗传信息处理)，而其余18个KOs在Probio-M8组中比安慰剂组更丰富(碳水化合物代谢[K00847、K02770、K02781、K03332；编码果糖和甘露糖代谢的不同途径]、细胞运动[K02389、K02397]、其他氨基酸的代谢[K00968]、膜转运[K02806、K18891]、蛋白质家族：遗传信息处理[K19339]、表征不佳的途径[K02426、K06877、K06921、K07075、K07128、K09976]和未分类的途径[K01447，K19336])。

讨论

骨质疏松症是一种代谢性骨病，它与破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成之间的动态平衡有关，通常使用常规药物或钙、骨化三醇等膳食补充剂来干预。肠道微生物群和骨质疏松症之间有很强的联系。基于益生菌恢复疾病相关的肠道微生物群失调的能力，我们探究了益生菌与常规药物联合干预在PMO患者骨代谢中的有益作用，发现Probio-M8与钙和骨化三醇联合使用3个月可以改善患者的骨代谢。

本研究结果显示，Probio-M8可改善骨质疏松患者的钙和磷代谢，同时提高骨质疏松患者的抗炎指标。血液中钙重要的两个调节因子是PTH和VD3。高PTH浓度增加骨的钙释放，导致骨吸收。既往多项研究表明，口服钙和多种益生菌可降低血液PTH水平，减轻骨吸收，这与我们的研究结果一致。我们还发现，在干预第3个月时，血清钙浓度仅在安慰剂组升高，而Probio-M8组没有，这可能是由于PTH的降低，这意味着骨矿物质的保留增多和骨吸收的减少。VD通过维持骨钙稳态、维持骨密度和防止骨吸收，在整体健康中起着至关重要的作用。联合给药Probio-M8可改善受试者的总血清VD3水平，血清VD水平升高表明钙吸收得到改善。

因此，Probio-M8组受试者血清中VD3的升高和钙的降低可能表明了骨形成活性的增加。此外，干预后Probio-M8组与安慰剂组中达到正常血清VD3水平(>30 ng/mL)的受试者比例为8：1，这表明益生菌可有效增加血清VD3和防止骨流失。血清PCT水平是全身炎症和自身免疫性疾病的生物标志物，摄入Probio-M8后PCT降低，表明Probio-M8可缓解骨质疏松患者的全身炎症。同时，PCT也是降钙素的前体，主要由甲状腺滤泡旁C细胞产生。一些研究一致发现，降钙素在超过生理剂量下应用可迅速抑制破骨细胞的功能。相比之下，PCT的生物学功能研究尚不一致。一些研究发现PCT与骨质疏松症的严重程度呈正相关，而其他研究发现PCT与OC呈负相关。因此，益生菌摄入后血清PCT下降的确切作用和机制有待进一步阐明。 联合给药Probio-M8降低了ALP和OC水平，它们是骨形成的生物标志物，而ALP也被认为是骨转换的标志物。

2014年，Britton等人在绝经期去卵巢小鼠模型中发现，摄入罗伊氏乳杆菌可降低骨特异性ALP水平，表明益生菌干预使骨转换减少和骨流失减少，与本研究一致。我们的研究观察到Probio-M8组的血清OC水平在第3个月时降低，而安慰剂组则没有，这与用长双歧杆菌干预16周后卵巢切除大鼠血清OC水平升高的结果形成对比。在骨形成过程中，成骨细胞合成后OC可直接释放到血液中；但在骨吸收过程中，它也可以通过破骨细胞的骨基质降解进入循环。另一方面，一项荟萃分析发现OC在葡萄糖代谢注入的血液循环中存在异质性，指出血清OC可能不是骨形成的良好指标，而是骨转换的指标。因此，与基线水平相比，Probio-M8组血清OC的下降似乎反映了在第3月时的骨转换状态的降低。

人类肠道微生物群被描述为“骨质疏松和成骨的关键介质”，而骨质疏松和骨质减少的女性的肠道微生物群也发生了改变。由于肠道微生物群可能在PMO的发病机制中发挥积极作用，它也可能作为管理PMO的治疗靶点。益生菌可以调节肠道微生物群，改善各种疾病的临床症状，如冠状动脉疾病、哮喘、胃肠道疾病。此外，之前的一些临床研究报道了益生菌干预可以改善骨骼健康，但很少有研究致力于分析益生菌驱动的肠道菌群反应与症状改善之间的相关性。因此，本研究中我们重点分析了受试者摄入益生菌后肠道菌群的变化。在三个月的干预后，我们发现无论是Probio-M8组还是安慰剂组，受试者的α多样性和肠道微生物群结构均未观察到变化。相比之下，Takimoto等人观察到，健康绝经后日本妇女使用Bacillus subtilis C-3102干预24周后，肠道微生物群的丰富度和多样性均增加。

这种不一致性可能是由于不同研究之间的干预时间和益生菌菌株的不同所致。虽然通常认为高度的多样性表明了“健康的微生物群”，但这种观点已受到了质疑。我们的结果表明，摄入Probio-M8只伴随着宿主肠道微生物群多样性和结构的适度变化。有趣的是，Probio-M8的肠道微生物互作网络与安慰剂组的肠道微生物互作网络不同。肠道微生物群与宿主健康密切相关，肠道微生物的互作网络反映了与肠道微生物群动态变化相关的健康状况改善和/或症状缓解。研究表明，摄入益生菌可以加强原生菌群的互作，抑制潜在的肠道病原体。这种方法也被用于确定饮食引起的人类肠道微生物群变化与代谢健康之间的联系。我们发现，在第3个月时，Probio-M8组的肠道微生物群相互相关网络增强。特别是普遍认为的有益菌，与一些主要产生的短链脂肪酸的类群的相关性，如双歧杆菌和Eubacterium、Blautia、Ruminococcus呈正相关；据报道，Ruminococcus与骨质疏松症的存在呈负相关。

因此，我们可以合理地推测，Probio-M8的摄入增强了肠道生态位中特定有益菌之间的联系，促进了PMO患者的健康。但值得注意的是，肠道微生物群互作分析本身并不能提供因果关系的可靠证据，这需要进一步验证。 肠道微生物群的调节通常会影响肠道宏基因组的功能。因此，我们分析了益生菌干预后宏基因组功能特征的变化。在Probio-M8组中，编码ABC转运体、磷酸转移酶系统、果糖和甘露糖代谢途径的基因均有增加。ABC转运体经常与糖苷水解酶编码基因共定位和共调控。磷酸转移酶系统是微生物物种中高亲和力碳水化合物摄取的常见机制。这些基因的增加提示了碳水化合物摄取和利用的增强。

此前有研究表明，给大鼠喂食果糖可诱导胰岛素抵抗，加速骨质疏松症，提示果糖摄入可能会加重骨质疏松症的发病机制。我们观察到，在Probio-M8摄入后，果糖和甘露糖代谢途径的编码基因丰度增加，这表明益生菌联合给药可以加速患者肠道中果糖的利用，减轻PMO症状。 此外，Probio-M8处理后，胆碱磷酸胞苷基转移酶(K00968)的基因丰度增加。胆碱磷酸胞苷基转移酶是哺乳动物细胞中磷脂酰胆碱生物合成的主要速率决定酶。中国受试者的血清磷脂酰胆碱水平已被证明与BMD相关，但相关方向取决于它们的化学结构和脂肪酸组合。例如，两种磷脂酰胆碱(分别为16:0/18:3