简化甲基化测序(RRBS)在植物表观基因组学中的机遇

研究表观遗传机制在生物和生态系统中的特征和影响对于理解表观遗传学的生态相关性非常重要，已开发多种具有成本效益的简化甲基化测序（RRBS），并将其应用于缺乏良好注释参考基因组的不同生物。新方法改善了生态环境中表观遗传多样性的评估，并可能提供功能性见解。本综述评估了RRBS在非模式植物物种中的机会和局限性。经过深思熟虑的实验设计，包括互补基因表达研究和目标群体基因组学资源改善，有望大限度地发挥未来RRBS研究的效果。

一、背景

生态表观遗传学旨在了解表观遗传机制对生态和进化过程的独特贡献。一些研究表明，DNA甲基化变化与生态因素相关，表明表观遗传学在适应中的潜在作用。然而许多非模式生物研究的低基因组分辨率无法准确分析表观遗传效应的因果关系，甚至在少数植物和动物模式生物的特性重也存在。近期研究讨论了如何将高分辨率表观基因组学工具与生态相关的实验环境设置相结合，以探索表观遗传机制的重要性，为评估表观遗传机制与生态和进化的相关性，这些方法需要应用于各种生物和条件。然而强大的表观基因组学方法在很大程度上只适用于少数模式物种。全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）是评估基因组胞嘧啶甲基化状态的“金标准”，但这种方法仍然局限于具有高质量参考基因组的物种，且WGBS对于大型实验设计来说，尤其是中到大型基因组植物，成本高昂。

简化基因组测序（RRBS）方法，仅对基因组重要表观调控区域进行深度测序，为WGBS提供了一种经济高效的替代方法。RRBS可扩展用于生态实验设计，可用于没有参考基因组的生物，并比以前基于标记的方法具有更高分辨率。RRBS reads还可以比对到参考基因组或参考基因组“草图”，并可能提供功能性见解。对于没有参考基因组的物种，RRBS可以仅为捕获的位点生成特异性参考，如通过在测序中非重亚硫酸盐转化的样本或从亚硫酸盐处理的reads本身推断未转化的参考。因其属性与成本效率相结合，RRBS方法对于研究生物的生态和进化表观遗传学更具吸引力。然而，重要的是要评估这些方法的优势和局限性，以确定哪些研究问题可以得到有效解决。

二、RRBS位点作为全基因组表观遗传标记

相比MSAP甲基化敏感扩增多态性技术或MS-AFLP/MAP等早期方法，RRBS技术可以在全基因组范围内探索DNA甲基化变化模式，在数万个片段中的每个片段中检测多个胞嘧啶位置。与早期方法不同，RRBS数据在核苷酸分辨率上是定量的，可以反应组织样本细胞间DNA甲基化的生物学特性。RRBS可以分析不同序列环境（CG、CHG、CHH）中的DNA甲基化信息，这些不同DNA环境中的甲基化与不同功能相关，受不同分子通路调控，已知具有不同遗传力和环境敏感性水平，从而为分析DNA甲基化的自然模式提供进一步工具。通过对RRBS数据进行整合以量化个体之间DNA甲基化的整体相似性，为描述自然群体内或群体间的表观遗传变化模式提供基础。

这种描述性的群体表观遗传学检测为表观遗传变化水平提供了有用的见解。如自然表观遗传种群结构在多大程度上与潜在遗传种群结构相关？与环境变化相关？在拟南芥自然种群、玉米实验种群和大豆重组自交系（RIL）的几项研究中观察到表观遗传和遗传结构之间的强相关性，表明表观遗传变化很大程度受遗传调控。这些研究主要检测差异甲基化区域（DMR）和相邻遗传多态性之间的关联，以表明顺式作用对DNA甲基化的遗传调控；同时还检测到反式关联，如CHH甲基化和染色体甲基转移酶CMT2的遗传变异之间的关联。然而当自发性突变稳定遗传时，在没有遗传调控的情况下也可能出现顺式和反式关联。此外有研究报道，表观遗传群体结构的一个组分没有受遗传结构调控，而是与生态条件相关。这表明表观遗传学可以直接或间接地促进适应：（1）表观遗传变化由环境条件诱导，并提供表型可塑性或长期遗传反应力；（2）与整体（平均）遗传群体结构不相关的表观遗传变化可以受单个遗传位点调控。

除表征自然DNA甲基化变化外，植物中胞嘧啶甲基化的高遗传力表明RRBS位点可以作遗传变异有限或缺失的杂交中连接比对目标的标记。此外DNA甲基化动力学的一般特征，如跨代稳定性、表观突变和逆转率，以及对感兴趣的实验或田间条件的响应，可以通过观察基因组中的多个（不一定是全部）位点来研究，因此可以利用RRBS方法解决。

三、RRBS位点的功能注释

RRBS片段中的DNA序列可以显示DNA甲基化差异基因组区域功能信息，尤其是增强子元件的表观遗传变化可以驱动基因表达改变并产生功能性作用。RRBS为哺乳动物研究而开发，其中大部分基因启动子与GC富集区域（CpG岛）相关，这些区域的甲基化状态对基因调控具有功能性影响。使用偏向GC富集位点（如MspI）的限制性内切酶，哺乳动物中的RRBS通过仅靶向整体基因组的一小部分来评估80%-90%的CpG岛甲基化水平，而典型的植物基因组缺失CpG岛，基于MspI的基因组代表性减少不会导致对基因启动子偏倚。然而通过选择不同的限制性内切酶、增加整体基因组代表性，可以在植物中实现对基因体或基因启动子区域的偏倚，如当覆盖率增加到整体基因组约19%时，使用限制性内切酶MseI的RRBS在玉米中捕获＞80%的注释基因启动子区域。使用不同的酶（CviQI）对15%基因组＞80%的基因体进行测序，基因组功能组分的富集可以对功能进行深入研究，如Hsu等人（2017）鉴定出与特定启动子DNA甲基化谱相关的组织特异性表达基因。此外，基于RNA-seq或qPCR的表达分析可以配合补充RRBS数据集，揭示与DNA甲基化变化相关的基因表达变化。

四、 RRBS方法对非模式物种的局限性

RRBS可以靶向基因组的功能区域，但非模式物种中RRBS位点的基因组背景鉴定通常仅限于与注释物种同源性的片段。随着基因及其功能的不断发展演变，这种方法可能会影响对非模式物种中获得信息的正确解释。在没有参考基因组的情况下，参考转录组可以帮助改善功能预测，但即使大部分RRBS片段与注释良好的转录组交集或用已知的植物基因注释，实际上只有一些片段与基因的5'末端有交集，其中DNA甲基化增加与基因沉默相关。植物5'末端之外的基因体甲基化功能相关性因环境和分类群而不同，且基因体甲基化通常与基因表达不相关或仅呈弱相关。因此，尽管启动子区域甲基化与基因沉默强相关，但如果没有目标物种或近亲注释良好的参考基因组，则很难甚至不可能鉴定出与启动子区域交集的RRBS片段。另外中到大型基因组的植物可能没办法获得足够的基因组覆盖。

RRBS方法比早期方法更能检测异常位点或鉴定高FST位点，表明RRBS可以在生态重要基因组区域上进行选择。表观遗传信号的共遗传可能不太稳定且RRBS可能遗漏的一个或几个相邻基因组元件，相对较少功能位点调控的性状可能在RRBS中被遗漏，这个问题在基因组大而复杂的物种中被放大。

RRBS的另一个难点在于鉴定差异甲基化区域（DMR）。对多种物种的研究发现，与单个胞嘧啶的差异甲基化位点（differentially methylated positions ，DMP）相比，大染色体片段的DMRs甲基化变化更可能影响附近位点的转录活性，并导致表型变化。但即使在全基因组甲基化研究中，DMR也难以定义。RRBS捕获的短片段（<500 bp）仅包含几个胞嘧啶位点，且在多数情况下用这些数据calling具有统计意义的DMR很困难，因此大多数RRBS研究更倾向固有随机calling DMP。

植物基因组进化由多倍体化和杂交形成，它们在植物多样化和适应中发挥了重要作用。采用高深度的测序方法来鉴定重复位点的所有拷贝，尤其对于杂合度高的位点，且会因为低分辨率的短片段而需要更高深度测序。这意味着在特定位点上分析不同拷贝的多态性数量将分级为基因组中不同位点的多态性数量。这一水平的基因组景观信息虽然仅限于极少数非模式物种，但对理解序列水平和甲基化变化对生态和进化的重要性产生深远影响。

揭示表观遗传变异在不同系统和环境中受遗传变异调控或部分自主的程度仍然是理解表观遗传变化的生态和进化作用的关键挑战。RRBS数据为评估整体遗传和表观遗传群体结构提供了足够的信息，从而可以评估两者之间的整体相关性。原则上用全基因组甲基化数据比RRBS数据能更好地解决这个问题，但在缺乏全基因组甲基化数据的情况下，RRBS在鉴定单个表观遗传变化的遗传决定因素方面受到限制。

五、大限度地提高RRBS对植物的作用

无论是作为遗传信号，还是对环境条件或实验处理的塑性反应，RRBS都能检测表观基因组景观中的变化模式。然而鉴定局部适应需要在田间的对等移植研究或在受控环境中实验来检测特定的生物反应模式，理想情况下可以调控所有遗传影响。仔细设计实验条件对于评估表观遗传变化尤为重要，合理的实验设计可以得到关于表型可塑性基础变化的信息来揭示表观遗传机制，并鉴定与遗传差异或起源生境相关的变化。分析至少三代的子代可以更好地评估标记物的跨代遗传性，但需要仔细考虑子代的生长环境。

RRBS的灵敏度可以通过多种技术方法来改善。如限制性内切酶的选择决定了捕获的基因组区域，甲基化敏感酶将靶向植物基因组中高甲基化重复区域，从而富集到编码区域。但这些酶可能会导致丢失数据，尤其在DMR中。GC富集的限制性位点的酶会向重复区域偏倚，因为几种转座元件（TE）与AT富集的基因组区域相关。此外，无论基因组背景如何，限制性内切酶（具有更短的识别序列）可以增加基因组的代表性。此外，RRBS还可以通过利用产生更长reads的平台（如MiSeq）或通过使用配对末端测序方法优化文库以跨更大区域获取信息（如Illumina的bsRADseq高达800bp）来改进，这增加了注释和calling DMR的可能性，并可能鉴定启动子。

DNA甲基化分析需要一些额外的考虑因素，因为重亚硫酸盐测序可能难以区分取代（substitutions）和表观等位基因（epialleles）变化。尤其C或G突变为A或T可能看起来是表观突变，因为亚硫酸盐处理将未甲基化的胞嘧啶脱氨成尿嘧啶，然后尿嘧啶通过PCR扩增与胸腺嘧啶配对，单个参考基因组提供不了区分这些可能性所需的信息。由于RRBS与WGBS相比具有成本优势，即使是用于区分个体间遗传变异与甲基化变化的大型实验设计，也可以对每个种质的未转化参考进行测序。

六、结论

在过去几年中出现了几种RRBS方法，增加了非模式物种表观遗传学研究的潜力并扩大了研究范围。这些方法提高了基于标记方法的分辨率，但它们在没有良好参考基因组物种中的功能作用方面还存在局限性，主要局限于难以将RRBS片段靶向功能相关的DNA甲基化环境——启动子区域和转录区域的5'末端。尽管存在富集特定基因组的方法，但生成参考基因组草图对于定位启动子区域和更好利用RRBS数据至关重要。因此，改善各种生物的基因组学资源是理解表观遗传机制在生态和进化中的重要作用的关键环节。