纳米抗体如何突变实现protein A亲和力纯化

纳米抗体（Nbs）在添加His标签后，可通过亲和层析方法方便地进行纯化。然而，这种Nbs的C端标签可能会对其药代动力学产生不利影响，因此，开发替代His标签的纯化方法显得尤为重要。葡萄球菌蛋白A（ProA）是金黄色葡萄球菌表面的蛋白，可以高亲和力结合IgG分子的Fc区域，被广泛用于分离和纯化抗体，同时也可与人的重链家族-3可变结构域（VH）结合。虽然Nbs也属于同一家族，但并非所有Nbs都能与ProA结合。本期内容为大家介绍一篇文献报道，该研究通过特异性位点突变，将原本不与ProA结合的Nbs成功突变为可以结合ProA的型，并且这些Nbs突变体保持了其原有的热稳定性和抗原亲和力，同时不影响其在体内的生物分布。

抗体与ProA结合的关键残基

在这项研究中，研究者选择了四种hHER2特异性的纳米抗体2Rs15d、2Rb18a、2R5a 和 2Rb17c，和一种hPD-L1特异性的纳米抗体CD274Cl4。其中，2Rs15d和CD274Cl4无法结合ProA，其余三种都可结合ProA。

通过Fab-ProA晶体结构分析，发现与ProA相互作用的13个氨基酸中，有7个是关键位点，分别为R20、G74、R75、T77、S79、Q90和N92，而其余6个较不关键，G16、S18、T65、Y67、K72和S93（IMGT编号）。

研究者将5种Nbs序列与人VH进行比对，以确定它们这13个位置上的氨基酸对应关系。其中，G16、S18、T65、K72、G74、R75、T77、S79、Q90和N92在所有选定的Nbs中都是保守的。只有2Rs15d和CD274Cl4序列中的R20 K和Y67H差异以及单个S93D与理想的ProA结合残基不符。因此，这些位点的差异可能是导致2Rs15d和CD274Cl4无法与ProA相互作用的原因。

位点特异性突变

2Rs15d的突变体引入了K20R, W66Y, H67Y突变。CD274Cl4的突变体引入了D93S，和自发的L89M突变。

作为对照，在2Rb18a和2Rb17c中引入了R20K突变，以确认R20在与ProA结合中的作用。

测试突变体在ProA树脂上的吸附能力

通过LDS-PAGE和考马斯蓝染色野生型和突变体与ProA的结合。

染色结果显示野生型2Rs15d和CD274Cl4不与ProA结合，2Rs15d突变体大部分结合到ProA树脂上，CD274Cl4突变体能与ProA结合，但亲和力降低，因为大部分蛋白质仍在RNB中。相反，2Rb17c、2R5a和2Rb18a突变体不再与ProA结合，证实了R20突变残基是ProA结合的关键位点。

突变体的热稳定性和抗原亲和力

引入ProA结合位点的突变应对纳米抗体本身的稳定性和亲和力影响甚微。

热变性谱分析（TSA）显示野生型和突变体之间熔点温度（Tm）大偏移为1.0 °C，证实突变残基对热稳定性的影响微不足道。表面等离子共振（SPR）检测显示引入或去除ProA结合位点的亲和力差异保持在3倍以内。

ProA结合和非ProA结合纳米抗体的体内分布

将纳米抗体用作临床放射示踪剂，需要确保其在突变后仍保持有利的药代动力学特性。通过99mTc标记纳米抗体进行了小鼠生物分布研究，研究结果显示，在WT和突变体之间，肾脏富集度都没有明显差异。

解剖后的器官分析显示，WT和突变Nbs之间的肾脏内%IA/g没有差异。抗-hPD-L1纳米抗体在肾脏中的放射性活性保持在50 %IA/g以下，而hHER2纳米抗体则保持在300 %IA/g左右。在其他器官中没有观察到明显的标记纳米抗体摄取，仅在肝脏、胆囊和肠道中观察到非常小的%IA/g。

小结

相较于Ni-NTA，使用ProA的亲和层析在Nbs的纯化中具备优势。这是因为ProA仅识别特定的构象表位，只会选择正确折叠的蛋白质。而使用His标签或其他短肽标签的纯化方法，则不区分蛋白质是否正确折叠，捕获所有带有该标签的分子。此外，通过引入ProA结合位点，Nbs可以在无需任何纯化标签的情况下进行通用纯化。这不仅解决了Nbs的C端标签可能对体内分布造成的影响，还保持了抗体本身的稳定性和亲和力。