鞭毛重组蛋白A干扰巨噬细胞自噬的机制研究

嗜肺军团菌（legionella pneumophila，LP）是一类单极鞭毛革兰阴性杆菌，能引发军团病。LP可入侵人肺泡巨噬细胞，阻碍巨噬细胞自噬，躲避巨噬细胞对其清除，并在巨噬细胞内增殖，达到感染宿主的目标。LP 的脂多糖、菌毛、鞭毛等都与军团菌的致病性相关，鞭毛蛋白是其重要的毒力因子，可加强病原菌的侵袭。

鞭毛蛋白是 Toll 样受体 5（TLR5）的特异性配体，TLR5 作为模式识别受体[5]，在致病菌侵袭宿主时，TLR5 依靠胞外的 LRR 蛋白结构域（LRR domain）识别鞭毛蛋白，并触发依赖髓样分化因子 88（MyD88）的信号通路，激活微管相关蛋白激酶（microtubule -associated protein kinase，MAPK）和核转录因子-κB（nuclear transc[x]ription factor-κB）诱导的炎性反应，有效清除病原体。

使用LP 鞭毛重组蛋白A（rflaA）干预RAW264.7巨噬细胞，发现组蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6，HDAC6）增高。HDAC6是一种位于细胞质的去乙酰化酶，参与多种生物过程的调控，包括自噬、热休克反应和肿瘤进展等。HDAC6还参与了线粒体吞噬和错误折叠蛋白向溶酶体和蛋白酶体的运输。为了探究HDAC6在rflaA抑制巨噬细胞自噬中的作用，研究人员选择 HDAC6-/-C57BL/6J 小鼠巨噬细胞作为此次实验的研究对象。

采用支气管肺泡灌洗法提取C57BL/6J与HDAC6-/-C57BL/6J两种小鼠巨噬细胞，用小鼠巨噬细胞表面标记物F4/80鉴定；纯化rflaA，CCK-8 法检测其对小鼠巨噬细胞半数抑制浓度（IC50），筛选佳作用浓度用于后续实验；rflaA分别干预C57BL/6J 及HDAC6-/-C57BL/6J小鼠巨噬细胞6、12和24 h，RT-qPCR、Western blot 及免疫荧光检测各组自噬相关因子自噬效应蛋白1（Be－clin1）、自噬相关蛋白 5（ATG5）、自噬微管相关蛋白轻链 3（LC3）、SQSTM1 蛋白（P62）的表达水平。

根据CCK-8结果计算，IC50为0.41 μg·μL-1，佳作用浓度为0.041 μg·μL-1用于后续实验；RT-qPCR、Westernblot、免疫荧光结果显示，rflaA干预C57BL/6J小鼠巨噬细胞后，与0 h相比，6、12、24 h HDAC6的表达水平升高，LC3、ATG5表达水平均降低，P62的表达水平升高，Beclin1的表达水平先降低后升高（P 均＜0.05）；rflaA干预HDAC6-/-C57BL/6J小鼠巨噬细胞后，与0 h 相比，6、12、24 h LC3、ATG5、Beclin1表达水平均升高，P62的表达水平降低（P均＜0.05）；在相同的时间点，与C57BL/6J小鼠巨噬细胞各组相比，HDAC6敲除后各组细胞ATG5、LC3 表达水平升高，Beclin1先升高后降低，P62降低（P均＜0.05）。

 RT-qPCR 检测敲除 HDAC6 对 rflaA 干预小鼠巨噬细胞不同时间点自噬相关因子 mRNA 表达的影响

Western blot 检测敲除 HDAC6 对 rflaA 干预小鼠巨噬细胞不同时间点自噬相关因子蛋白表达的影响

LP rflaA干预C57BL/6J小鼠单核巨噬细胞后，能抑制其自噬，提示rflaA可能被TLR5识别，激活炎症小体使巨噬细胞内脂质化的LC3脱脂，特异性地阻断LC3-PE和ATG5相互作用，脱脂后的LC3未与溶酶体融合，从而阻断自噬体-溶酶体途径，LC3、ATG5的表达降低，吞噬体-溶酶体融合受损导致P62积累，积累的P62会与HDAC6结合通过泛素结合区来维持其去乙酰基酶活性，导致α-tubulin的去乙酰化，P62通过维持HDAC6活性使微管不稳定从而抑制自噬。

随着时间发展，巨噬细胞的功能逐渐恢复，rflaA的抑制作用减弱，HDAC6 的活性开始恢复，表达水平升高，诱导表达的Be－clin1表达水平升高，Beclin1-PIK3C3复合体形成增多，自噬活性开始逐渐恢复。

HDAC6作为一种去乙酰化酶，当HDAC6敲除后，rflaA对巨噬细胞自噬的抑制作用降低，巨噬细胞乙酰化作用增强，微管蛋白稳定性增加，微管的运输功能恢复，有助于恢复自噬通量，乙酰化酶P300乙酰化修饰LC3，导致LC3表达增加。细胞自噬途径激活LC3表达上调后，自噬诱导Beclin1的乙酰化作用增强，Beclin1乙酰化能够促进自噬体的成熟和降解，自噬小体和自噬溶酶体融合顺畅，自噬作用增强，Beclin1表达升高。而LC3靶向自噬体膜是由ATG5 决定的，ATG5的表达也相应升高。

HDAC6和P62作为泛素结合蛋白，参与自噬调控。HDAC6 催化从各种细胞质蛋白中去除乙酰基，并包含一个泛素结合域，通过此结合域将错误折叠和损坏的蛋白靶向到自噬小体中。当细胞蛋白质被破坏时，聚集体的形成就会发生。聚集体的形成是一种对错误折叠损伤蛋白的细胞保护反应，并通过自噬诱导其清除。这些蛋白酶体与P62共定位，并通过选择性巨自噬被清除，所以当敲除HDAC6后，为了促进泛素聚集体和自噬降解，P62为了招募吞噬体膜上的LC3膜蛋白用于自噬体成熟，而自身被自噬降解，故自噬底物P62减少，P62的表达下调。

这充分表明，HDAC6 促进rflaA抑制小鼠巨噬细胞自噬，HDAC6可能通过影响微管蛋白乙酰化干扰巨噬细胞自噬。这项研究为HDAC6在rflaA干扰巨噬细胞自噬中的影响提供新的思路，为进一步了解HDAC6在LP鞭毛蛋白致病机制中的作用奠定基础。