多重耐药临床菌株中整合子结构的检测与分析

【关键词】  ,整合子；,,整合酶；,,细菌耐药；,,临床分离株

　　摘要：  目的  研究广州暨南大学附属医院2004年部分临床菌株样本的整合子及其基因盒的分布特性。方法  多重PCR检测与细菌耐药关系密切的1、2、3类整合酶基因，进一步对阳性样本可变区的基因盒序列鉴定分析。结果  随机抽取109株临床菌株，整合酶阳性检出率为972%(106/109)，其中1类整合酶阳性菌100株(917%)，2类整合酶阳性菌1株(092%)，此外有5株(46%)同时检出1、2类整合酶，没有检测到3类整合酶；基因盒鉴定结果显示，插入基因盒以dfrA(甲氧苄氨嘧啶耐药相关)和aadA(氨基糖苷类耐药相关)基因家族为主，也在少数菌株中发现了aacA4、cmlA1、catB3以及sat1基因盒。其中又以dfrA12、orfF和aadA2组合为常见，耐药基因盒PCR扩增片段为1913bp(646%)；此外，还发现了同时存在两种整合子结构的菌株。结论 整合子普遍存在于临床菌株中，可通过基因水平转移在不同菌属间传播，提示各医药单位必须加强耐药监测及合理选择抗菌药物，以减少多重耐药细菌的发生和发展。

　　关键词：  整合子；  整合酶；  细菌耐药；  临床分离株

　　Detection and characterization of integron structure　in clinical bacteria isolates

　　Shi Lei,  Chen Xun  and  Xiao Zenghuang   

　　(School of Light Chemistry and Food Science, South China University of Technology,  Guangzhou 510640;School of Biological Science and Engineering, South China University of Technology,  Guangzhou 510640;First Affiliated Hospital of Medical College, Jinan University,  Guangzhou 510630)

　　ABSTRACT  ob[x]jective  To investigate the distribution, characterization and relativity between multiresistance and integrons.  Methods  In this study, the presence and genetic content of 3 classes integrons among 109 clinical strains were examined by multiple PCR and sequencing. Restricted enzymefragment length polymorphisms (RFLP) was also used for the homology of the gene cassettes.  Results  intI1 was detected in 917% of the isolates; intI2 was detected in 1 (092%) isolates, both intI1 and intI2 were detected in other 5 (46%) isolates and no intI3 was detected. Twelve different genes, including 10 genes  respondible for antibiotic resistance and 2 unknown genes, were detected. The genes most commonly found in integrons were those for aminoglycoside (aadA) and trimethoprim (dfr) resistance. Bacteria contain more than one integron were also found in this study.  Conclusion  Resistance mediated by integron was extensively existed in clinical isolates of both Gramnegative and Grampositive bacteria. It seems that the integrons are more widely existed than we expected. It implied the necessary for surveillance horizontal transference of antibiotic resistance gene(s) among bacteria genus.

　　KEY WORDS  Integron;  Integrase;  Antibiotic resistance of bacteria;  Clinical isolates

　　抗生素的发现与应用，使人类成功治愈了许多感染性疾病，是人类医疗发展史的里程碑。然而，随着抗生素的广泛使用(包括医疗、畜牧、养殖业)及不恰当使用，细菌耐药性问题正日趋严重。微生物群落特别是病源微生物，面临强大的抗生素选择压力，演化出许多不同的耐药机制。已有报道，耐药基因可通过各种基因元件的水平转移在微生物群落间传播，包括质粒、转座子和噬菌体等可自主转移的元件都可以作为耐药基因传播的载体［1］。目前已经证实整合子元件能介导耐药基因在不同菌群间有效的传播［2］。整合子为自然界存在的具有捕获、整合以及表达基因盒能力的基因表达系统。典型的整合子结构包括了5′端保守序列(5′CS)和3′端保守序列(3′CS)以及中间的可变区，整合酶基因(intI)、启动子及整合位点(attI)位于5′CS，基因盒整合于attI下游；3′CS则因整合子类型不同而异。基因盒通常不含有启动子，其表达依赖位于整合子5′保守区域的启动子，在启动子的作用下耐药基因得以表达［2］。目前已发现的整合子结构中，第1、2和3类整合子的研究为普遍和详细，并已证实与细菌的耐药性有关［3］。其中常见的是第1类整合子，在临床检测中具有重要意义，它可以通过首尾相接的方式整合一个或多个耐药基因盒，形成多重耐药，对人们的健康形成严重威胁［4］。因此对整合子的分布情况进行监测是十分必要的。一般认为整合子广泛的存在于革兰阴性菌中，并介导其产生耐药性。近来越来越多的研究却表明，整合子在介导革兰阳性菌多重耐药中也起着重要的作用［5，6］。为此本实验对109株随机临床菌株样本进行整合子分布的检测，并进一步对其携带的基因盒作了分析与鉴定。

　　1  材料和方法

　　1.1  菌株本实验所用菌株分离自2004年暨南大学附属医院住院患者临床标本，共109株。包括各种常见病原菌(Tab.1)，其中革兰阳性菌23株，革兰阴性菌86株。V.cholerae O1 strain SK 10(Dr. Dalsgaard惠赠)，E.coli DH5α 携带质粒pR483:Tn7(Dr. Falbo惠赠)，E.coli DH5α携带质粒pSMB731(Dr. Hall惠赠)分别作为第1、2、3类整合子的阳性对照；E.coli C600(山崎伸二教授惠赠)为阴性对照菌。

　　1.2  药敏检测临床标本菌株的药敏检测实验由暨南大学附属医院临床检验中心完成，采用纸片扩散法。药敏结果判断参照NCCLS(2004)标准。

　　1.3  DNA模板的制备DNA模板的制备，采用改进的SDSCTAB方法［7～9］。

　　1.4  整合子的检测以检测整合酶基因的存在与否为依据，采用多重PCR(multiplex PCR)的方法。根据1、2、3类整合子的整合酶基因(intI)序列分别设计具有相同或相近退火温度的三对引物，并确保获得不同大、小的扩增片段，以便电泳检测鉴定(Tab.2)。设计的引物经Clustal W及Blast分析，确定与GenBank数据库中非目的序列无同源性。所有引物由上海博亚生物技术有限公司合成。PCR反应体系为50μl，含15μl DNA模板(约100ng)，02pmol/μl 第1类整合酶引物，02pmol/μl第2类整合酶引物，1pmol/μl第3类整合酶引物，125U Taq DNA聚合酶，25mmol/L dNTP，5μl 10×PCR缓冲液(宝生物公司)。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s；72℃延伸2min，共30个循环，后72℃延伸7min。

　　1.5  基因盒检测与鉴定通过PCR检测整合酶基因，确定细菌携带整合子的情况，并针对第1、2类整合酶阳性菌株进一步以保守序列引物扩增整合子的可变区［9，10］。耐药基因盒扩增反应体系为50μl，含15μl DNA模板(约100ng)，06pmol/μl引物，125U Taq DNA聚合酶，25mmol/L dNTP，5μl 10×PCR缓冲液(宝生物公司)。循环参数同上，在进行第2类整合子可变区扩增时将退火温度升高到55℃。PCR产物均由琼脂糖凝胶电泳检测，EB溶液染色，BIORAD Gel Doc EQ凝胶成像系统进行结果分析。

　　1.6  可变区扩增产物序列分析不同的扩增产物经胶回收纯化后，连接到pGMT载体，转化到E.coli DH5α中，-20℃冻藏，以供测序及后续研究使用。测序工作由上海博亚生物技术有限公司完成，测序结果经Blastn检索GenBank 数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得同源信息，分析其可能的功能。对片段大、小相同的扩增产物选择合适的限制性内切酶，进行多态性分析，酶切反应体系20μl，包括：PCR产物8μl，酶缓冲液2μl，内切酶1μl，无菌去离子水定容至20μl。37℃恒温反应1h，加入3μl 10×LoadingBuffer终止反应，3%琼脂糖凝胶电泳检测。分子量大、小和酶切图谱均相同的扩增子被认为是相同的。       

　　Tab.1  （略） 

　　Tab.2  （略）

　　2  结果

　　2.1  药敏结果试验菌株对常用的18种抗生素做药敏检测，结果显示所有菌株均表现为3种以上的耐药性，近40%的菌株甚至对9种以上的抗生素耐受。常见的耐药表型包括：氨苄西林耐药(846%)，萘啶酸耐药(802%)，壮观霉素耐药(820%)，链霉素耐药(811%)，磺胺甲基异口恶唑/甲氧苄氨嘧啶耐药(803%)等。

　　2.2  整合子检测结果109株临床菌株中106株(972%)检测到整合酶基因(intI)存在，其中100株(917%)仅检测到1类整合酶，1株(09%)只存在2类整合酶基因，另有5株(46%)在检测中发现同时含有1、2类整合酶，没有发现第3类整合子(Tab.1)。检测结果显示整合子可普遍存在于不同菌属中，包括革兰阴性菌和革兰阳性菌。在对整合子阳性菌可变区基因盒扩增中，共获得9条不同大、小的片段，构成13种不同的电泳图谱(Fig.1)；同时，也获得了10株(92%)可变区扩增阴性样本，出现这一现象存在两种可能的原因，其一是该整合子缺失了3′CS部分序列［11］；此外该整合子可变区很大，超出了rTaq酶的扩增范围也是原因之一。

　　2.3  可变区基因盒序列分析可变区扩增阳性菌96株，其中对6株含有2类整合子结构的菌株以引物TiF/TiB进行可变区扩增时，均获得的2385bp片段；对1类整合子可变区扩增时，结果表现出更丰富的多样性，51株获得1913bp的扩增产物，9株得到1664bp的片段，9株获得200bp的扩增产物， 4株获得1009bp的扩增产物，3株得到635bp的片段，2株获得1179bp的扩增产物；还有1株获得2360和2655bp的片段(Tab.1)。将大于500bp的片段送上海博亚生物技术有限公司进行序列的测定。对来自Staphylococcus aureus GH39的约20kb片段进行序列检测，分析结果表明该片段序列全长1913bp，含有三个开放阅读框ORF(dfrA12、orfF和aadA2)，其中dfrA12和aadA2分别与甲氧苄氨嘧啶和氨基糖苷类抗生素耐药相关，orfF为未知功能ORF； 同样，对来自Proteus mirabilis GH221的约16kb片段测序， 序列全长1664bp， 含两个ORF(dfrA17和aadA5)，分别与甲氧苄氨嘧啶和氨基糖苷类抗生素耐药相关， 与GenBank accession no.AY748452序列具有高度的同源性，其中耐药基因盒dfrA17与之完全一致，而耐药基因盒aadA5仅有1个碱基的差异(nt567 T→C)，编码的氨基酸没有变化，其编码蛋白的功能是一致的；对来自Klebsiella pneumoniae GH339的约12kb片段测序，全长1179bp，含有2个ORF(dfrA1和orfX)，其中dfrA1为甲氧苄氨嘧啶耐药相关基因盒，orfX为不同于orfF的未知功能ORF；对来自Pseudomonas aeruginosa GH227的约10kb片段测序，序列全长1009bp，分析结果显示仅有1个ORF(aadA2)，经Blastn发现该ORF序列与GenBank accession no. AR387523中的aadA2基因盒(编码氨基糖苷类抗生素耐药相关的基因盒)有很高的同源性，只存在2个碱基的差异(nt429 T→C，nt500 A→G)，导致1个编码氨基酸发生变化(第167位的K→R)。另外，在1株Acinetobacter baumannii GH140中同时获得的约23和约26kb两个片段，序列全长为2360和2655bp，分别为aacA4、cmlA1基因盒组合以及aacA4、catB3和dfrA1基因盒组合，其中aacA4为编码卡那霉素耐药相关基因，cmlA1与catB3同为编码氯霉素耐药相关基因。在2类整合子可变区获得的约25kb扩增产物，序列分析结果为2386bp，含dfrA1、sat1、aadA1基因盒，sat1与链丝菌素耐药有关。对来自Staphylococcus，coagulase negative GH69的635bp片段的分析显示，在NCBI已登陆的数据中，并为发现与此片段同源的序列，对其可能的功能有待进一步的研究。

　　Fig.1 （略）

　　3  讨论

　　近些年来，细菌耐药问题已引起全球范围的关注，目前认为细菌产生耐药性的主要方式是通过细菌之间的基因水平传递从环境中获得耐药基因，并已证实整合子是耐药基因储存和转移的重要结构［12，13］。本实验对109株临床菌株整合子检测结果，972%(106/109)含有整合子结构，对其可变区分析表明，这些整合子中普遍蕴含1个以上的耐药基因盒，证明了整合子广泛分布于各种菌株中，并富含耐药基因盒。与其它国家或地区的同类检测相比，本实验整合子检出率远高于平均水平，一般在50%左右［14～16］，分析有以下可能的原因：①本实验样本均为分离自患者的临床菌株，且选择了药敏测试中具有多重耐药表型的高耐药菌；②在实验设计上，目的在于同时检测1、2、3类整合子的分布，设计了两组引物分别针对整合酶基因上下游序列及整合子5′和3′端保守序列(Tab.2)，进行双重检测，以降低漏检的几率。然而，许多研究者以检测第1类整合子为目标，只通过5′和3′端保守序列PCR扩增为依据确定整合子的存在，可能会出现漏检的情况，因为近来不少报道指出有部分1类整合子的3′端保守序列是不完整甚至是缺失的［11，14］。因此这类整合子在耐药基因盒PCR扩增中会出现假阴性的情况，本实验中也发现了类似情况(Tab.2)。为此，设计了一对针对3′端保守序列的引物以及结合整合酶基因反向扩增的方法，对整合酶阳性而保守端PCR阴性的样本进行3′端和基因盒的确认(资料未发表)。因此出现如此高的整合子阳性率是与实验预期相符的。试验菌株1类整合子可变区扩增产物获得了15种谱型，常见的片段大、小为1913和1664bp(Tab.2)。序列分析结果表明常见的是编码甲氧苄啶耐药和链霉素壮观霉素耐药的两大基因家族，dfrA和aadA。与国内、外的许多研究结果是一致的［4，6，11，15］，同时与药敏测试中表现的高磺胺甲基异口恶唑/甲氧苄氨嘧啶(803%)和壮观霉素(820%)、链霉素(811%)耐药结果吻合。对2类整合子可变区扩增发现仅得到单一的谱型，携带相同的基因盒dfrA1、sat1和aadA1，分别编码甲氧苄啶耐药、链丝菌素耐药和链霉素壮观霉素耐药，有趣的是目前所有有关2类整合子携带基因盒的研究中，均获得同样的结果［14］，这一现象有待进一步的研究。上述结果表明dfrA和aadA两个基因家族与整合子关系为密切，在1类和2类整合子中都是出现频繁的，是整合子介导的常见的耐药基因型。然而整合子携带的耐药基因并不能解释本实验菌株的所有耐药表现，说明存在着其它机制共同介导着细菌耐药表型；同时，在众多独立遗传的菌株中获得了同源的耐药基因片段，表明耐药基因通过整合机制在不同菌种间的传递十分频繁；此外，少数扩增子仅在某一菌种中多次出现，如仅在不同患者来源的Enterobacter cloacae菌株中获得200、1664和1913bp扩增产物，提示可能为同源感染。结合此次整合子阳性率特别高的特点，可以推测此地区菌株面临着异常巨大的抗生素压力，以及可能存在的抗生素使用不合理情况。抗生素的广泛使用，使得细菌面临巨大的生存压力，在这一选择压力下，具有耐药基因的菌株得以存活并成为优势菌群，给人类健康及医疗带来巨大的困扰。也有研究者指出［11］，耐药基因的传递似乎并不仅仅依赖于选择压力。许多研究者发现，在对自然环境中的菌株(如野生动物或河水中分离菌株)做整合子检测时，同样获得了阳性信号，并且所携带的基因盒无明显差异［11，17］，但自然环境中的抗生素压力并不明显存在。同时也注意到，目前链霉素无论在医疗还是养殖业中的使用都已经大大减少，但aadA家族基因依然广泛分布于整合子中，继续介导着细菌对链霉素的耐受性。因此，推测有其它的机制影响着整合子对耐药基因的捕获与排除及传递［13］。还有研究者从另外的角度解释这一现象，他们通过比较各地区整合子基因盒及其相关启动子序列，推测带有某些特定基因盒结构的整合子比较稳定，并且认为整合子更多的以整体的形式传递，而非单独的基因盒的捕获与排除［18］。这也就可以解释为什么许多整合子携带完全相同的基因盒以及减少抗生素的使用，整合子中相应耐药基因盒的分布并不随着显著降低。虽然整合子并不是细菌耐药产生的原因，但整合子在其中的作用是不容忽视的。对整合子的监控可以帮助获得有关临床菌株产生多重耐药机制的重要信息。通过PCR的方法［19］，筛查细菌基因组中整合子的携带情况，能快速的提供有关细菌耐药和耐药基因播散的分子机制的有用信息，是现有的耐药性监测方案的有益补充，有助于治疗方案的选择。本次检测结果显示，整合子广泛分布于革兰阴性和阳性菌中，介导其产生多重耐药，应该注意加强监控。

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　　基金项目：教育部留学回国人员科研启动基金(200314)；广东省自然科学基金项目(04020050)；广州市科技计划项目(2004J1C0161)。
　　
　　(华南理工大学轻工与食品学院，  广州510640；华南理工大学生物科学与工程学院，  广州510640；暨南大学附属医院临床检验中心，  广州510640)