高良姜中二苯基庚烷A的含量测定及指纹图谱研究

【摘要】  目的 建立高良姜药材中二苯基庚烷A的含量测定方法及药材的指纹图谱。方法 采用RPHPLC法进行测定，色谱柱：C18柱（150 mm×4.6 mm,5 μm）； 流动相：甲醇水(体积比71∶29)；流速：1 mL/min；检测波长：220 nm。结果 15批高良姜药材经中药色谱指纹图谱评价软件分析，确定6个共有峰作为指纹特征峰。结论 二苯基庚烷A含量测定及指纹图谱的建立，为高良姜药材的质量评价提供依据。

【关键词】  高良姜　二苯基庚烷A　HPLC　指纹图谱

　　Contents and fingerprints of diphenylheptane A in Rhizoma Alpiniae Officinarum 

　　CUI Weili, FENG Yifan, GUO Xiaoling, MENG Qing

　　(Institute of Materia Medica，Guangdong College of Pharmacy，Guangzhou 510006，China)

　　Abstract:ob[x]jective  To analyze the contents and establish the fingerprints of diphenylheptane A in Rhizoma Alpiniae Officinarum.  Methods Samples were analyzed on an HPLC column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) by using methanolwater (71∶29) as mobile phase. Results Fifteen bathes of extracs from Rhizoma Alpiniae Officinarum were analyzed by Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation software, and 6 copeaks were identified as fingerprints. Conclusions The method can be used for the quality control of Rhizoma Alpiniae Officinarum.

　　Key words: Rhizoma Alpiniae Officinarum; diphenylheptane A; HPLC; fingerprint

　　高良姜为姜科山姜属植物高良姜(Alpinia officinarum Hance)的干燥根茎，其性热味辛，归脾、胃经,具温胃散寒、消食止痛的功效，用于脘腹冷痛、胃寒呕吐、嗳气吞酸等［1］。高良姜中的二苯基庚烷类化合物具有镇痛抗炎，抗氧化等多种生理活性，广泛应用于炎症、溃疡、血栓等的预防与治疗［2,3］。目前国内尚未见以二苯基庚烷类化合物含量测定作为控制高良姜药材质量的研究报道。本研究建立了高良姜药材中二苯基庚烷A［1苯基7(3′甲氧基4′羟基)苯基5醇3庚酮］的含量测定方法，并应用评价软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版》，建立了高良姜的HPLC色谱指纹图谱，以此作为高良姜药材质量控制的依据。结果表明该方法可操作性强，重复性好，可比较不同产地高良姜药材的内在质量差别。

　　1  仪器与试药
   
　　Waters 26952996高效液相色谱仪,Empower工作站； BP210 D型十万分之一天平(德国Sartorius公司)；DL360A超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)；评价软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年A版》（中国药典委员会）。
   
　　二苯基庚烷A对照品［自制，按HPLC面积规一化法计，质量分数>98.0％］；甲醇(色谱纯)；三蒸水；石油醚（60～90 ℃）。各批号高良姜药材为各地收集的市售产品，经广州中医药大学李卫民教授鉴定均为姜科植物高良姜的根茎。

　　2  方法与结果

　　2．1  溶液的制备

　　2．1．1  对照品溶液的制备
   
　　取二苯基庚烷A对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成质量浓度为1.034 mg/mL的溶液，摇匀，作为储备液，再精密吸取上述储备液1 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释并定容，得到质量浓度为103.4 μg/mL的对照品溶液。

　　2．1．2  供试品溶液的制备
   
　　取各批号的高良姜药材，粉碎后过40目筛，取粉末1 g，精密称定，置50 mL锥瓶中，加石油醚（60～90 ℃）20 mL超声提取3次，每次超声5 min，过滤，弃去滤渣，合并滤液，挥干溶剂，加甲醇溶解并定容到50 mL量瓶中，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

　　2．2  色谱条件
   
　　色谱柱：SunfireTM C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇水(体积比71∶29)；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃，进样量：10 μL。对照品与样品的色谱图见图1。

　　图1  对照品(A)、样品(B)的HPLC色谱图（略）

　　Fig.1  HPLC chromatogram of standard(A) and sample(B)

　　2．3  方法学考察

　　2．3．1  标准曲线
   
　　分别精密吸取质量浓度为103.4 μg/mL的二苯基庚烷A对照品溶液2、6、10、12、16、20 μL进样。以峰面积(A)对二苯基庚烷A的质量（m）回归，得回归方程A=1.721×106m-9×103，r=0.9998，表明二苯基庚烷A在0.2068～2.068 μg范围内线性关系良好。

　　2．3．2  精密度试验
   
　　精密吸取质量浓度为103.4 μg/mL的二苯基庚烷A对照品溶液10 μL，分别进样6次，以峰面积计RSD为0.22％，表明本试验精密度良好。

　　2．3．3  重复性试验
   
　　取批号为20030220的高良姜药材，精确称取6份，按“2．1．2”项下处理，测定其二苯基庚烷A的含量，二苯基庚烷A的含量为0.48％，RSD为2.19%，表明本试验重复性良好。

　　2．3．4  稳定性试验
   
　　精密称取取批号为20030220的高良姜药材，按“2．1．2”项下处理，在12h内分别测定二苯基庚烷A的含量，二苯基庚烷A的含量为0.49%，RSD为0.40％（n＝6），表明供试品溶液12h内较稳定。

　　2．3．5  加样回收率试验
   
　　取批号为20030220的高良姜药材粉末0.5 g，精密称定，精确加入二苯基庚烷A对照品2.61 mg(质量浓度1.305 mg/mL，加入2 mL)，按“2.1.2”项下处理，取10 μL进样。结果见表1。

　　表1  回收率试验（略）

　　Tab.1  Result of recovery test(n=6)

　　2．3．6  高良姜药材中二苯基庚烷A的含量测定
   
　　按照上述条件，分别对各批号的高良姜药材进行分析，并算出二苯基庚烷A的含量，结果见表2。

　　2．4  高良姜药材的HPLC指纹图谱
   
　　将S1～S15共15批高良姜药材提取物的色谱数据载入相似度评价软件，经软件分析计算确定出6个共有峰作为评价指标，建立了15批高良姜药材提取物的指纹图谱（相似度评价结果见图2，表3），并生成HPLC参照指纹图（见图3）。色谱图中，在3.089，3.503，4.007，6.313，8.109和17.401 min处分别有明显的色谱峰，这6个色谱峰为高良姜脂溶性成分的主要特征色谱峰和共有色谱峰。

　　图2  高良姜药材指纹图的相似度评价结果（略）

　　Fig.2  Similarity evaluation of the fingerprints of Rhizoma Alpiniae Officinarum

　　表2  样品中的二苯基庚烷A含量（略）

　　Tab.2  The content of diphenylheptane A

　　表3  高良姜药材指纹图的相似度评价结果（略）

　　Tab.3  Similarity evaluation of the fingerprints from the extracts of Alpinia officinarum Hance

　　图3  高良姜药材的HPLC参照指纹图谱（略）
 
　　3  讨论

　　3.1  本研究采用液相色谱质谱（LCMS）联用技术对高良姜石油醚提取物进行分析，鉴定图1B中4个色谱峰分别为二苯基庚烷A［1苯基7(3′甲氧基4′羟基)苯基5醇3庚酮，峰2］，二苯基庚烷B［1苯基7(3′甲氧基4′羟基)苯基4烯3庚酮，峰4］，二苯基庚烷C［1，7二苯基5醇3庚酮，峰5］和二苯基庚烷D［1，7二苯基5甲氧基3庚酮，峰6］。

　　3.2  取批号为20030220的高良姜药材粉末考察提取次数对二苯基庚烷A含量的影响，结果显示，药材提取1，2，3，4次(每次超声5 min)，二苯基庚烷A含量分别为(0.365±0.008)％，(0.452±0.005)％，(0.479±0.003)％，(0.484±0.005)％(n=3)，表明二苯基庚烷A已经被提取完全。故采用超声提取3次，每次5 min的方法制备供试品溶液。

　　3.3  本研究在建立高良姜药材的HPLC指纹图谱时发现，批号20070825的高良姜只有3.409和8.262 min两个色谱峰，且二苯基庚烷A含量偏低（见图4），故未将其列入指纹图谱之中。

　　图4  海南产高良姜的HPLC图（略）

　　Fig.4  HPLC chromatogram of Rhizoma Alpiniae Officinarum from Hainan Province

　　3.4  以上不同产地15个批号高良姜药材的HPLC指纹图谱表明，不同产地的高良姜药材HPLC色谱峰，均以二苯基庚烷A为主要的色谱峰。从二苯基庚烷A的含量测定结果来看，不同批号药材中二苯基庚烷A的含量差别较大，大相差4.5倍。

　　3.5  本文所建立的高良姜中二苯基庚烷A的含量测定方法及指纹图谱，可以作为高良姜药材质量评价和药材筛选的依据。建议在药材筛选时，应选择包含所有特征峰且二苯基庚烷A含量较高的药材。

 

【参考文献】
  　　［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京:化学工业出版社,2005：202.
　　
　　［2］ 黄初升，白素平，李瀛.天然线性二苯基庚烷类化合物［J］.天然产物研究与开发，1996，9（2）：98－104.

　　［3］ 李彩君，陈佃，何瑞.高良姜中二苯基庚烷类化合物研究进展［J］.时珍国医国药，2000，11（4）；367－368.

作者：崔维利

作者单位：广东药学院 中心实验室，广东 广州 510006