一氧化氮合成酶和心钠素在豚鼠耳蜗的分布

【关键词】  心钠素;,一氧化氮合成酶;,免疫荧光双标染色

　　[摘 要]  目的: 观察豚鼠耳蜗局部心钠素（ANP）和一氧化氮合成酶（NOS）免疫组化反应产物的分布及其相互关系, 为研究ANP和NOS在豚鼠耳蜗局部血流、 淋巴以及神经调节中的相互作用提供形态学研究的依据。方法: 采用免疫荧光组织化学双标法观察ANP和NOS在正常豚鼠耳蜗的分布特征。结果: 在耳蜗各转螺旋动脉和血管纹均发现ANP和NOS双阳性表达, 螺旋缘、 螺旋韧带和Corti器, 耳蜗神经节细胞有ANP和NOS双阳性染色。结论: ANP和NOS的分布特点显示, 二者在内耳血流调节, 内、 外淋巴平衡调节以及神经信号传递等方面可能存在密切的相互作用。

　　[关键词]心钠素; 一氧化氮合成酶; 免疫荧光双标染色

　　对一氧化氮（nitric oxide, NO）的研究表明, 其作为一种强有力的血管扩张因子, 存在于豚鼠耳蜗血管内皮、 神经节细胞及毛细胞中, 通过直接激活ATP敏感的钾离子（KATP）通道使豚鼠蜗轴螺旋动脉（spiral modiolar artery, SMA）的内皮及平滑肌细胞浓度依赖性地去极化, 引起血管扩张[1]。NO合成的关键酶一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase, NOS）主要分布于内外毛细胞、 蜗神经节细胞及耳蜗血管纹[1]。心钠素（atrial natriuretic peptide, ANP）也具有强大的扩张血管、 增加组织血流量及调节局部组织水电解质平衡等作用。ANP在内耳分布于螺旋韧带、 Corti器、 螺旋神经节、 血管纹及SMA等处, 参与调节耳蜗血流与内耳微循环平衡状态[2]。本实验我们采用免疫荧光双标的方法研究NO与ANP在内耳结构中的分布特点, 探讨NO与ANP对耳蜗局部环境的影响及其相互间作用。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  健康红目白色豚鼠, 雌雄不限, 体质量250～350 g, 购自第四军医大学实验动物中心。兔抗大鼠uNOS多克隆抗体为labvision公司产品, 小鼠抗人ANP单克隆抗体（mAb）为Chemicon公司产品, 购于晶美生物工程有限公司。Cy3标记羊抗兔IgG为Sigma公司产品, FITC标记山羊抗小鼠IgG为中杉金桥公司产品, 购于武汉博士德生物公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  组织标本制备  豚鼠5只, 戊巴比妥钠（60 mg/kg, 腹腔注射）麻醉后开胸, 经升主动脉灌注生理盐水300 mL冲出血液, 用40 g/L多聚甲醛500 mL（4℃）灌注固定1 h。取双侧耳蜗, 刺破圆窗膜,置于上述固定液中过夜; 后置于100 g/L EDTA（25℃）脱钙7～14 d, 移入250 g/L蔗糖缓冲液4～6 h后, 用OCT包埋, 平行蜗轴10 μm进行连续冰冻切片备用。

　　1.2.2  免疫荧光染色  冰冻切片滴加1∶500稀释兔抗大鼠uNOS多克隆抗体, 4℃孵育24 h; 甩去玻片多余液体, 直接添加1∶500稀释小鼠抗人αANP mAb, 4℃孵育24 h。001 mol/L PBS（pH74）洗3次, 避光同时添加二抗（稀释度均为1∶100）, 37℃孵育30 min后, 避光条件下001 mol/L PBS洗3次, 共聚焦显微镜下观察并拍照。

　　2  结果
   
　　镜下可见, 在耳蜗各转的血管纹均有ANP和NOS分布（图1）。耳蜗各转螺旋韧带可见ANP和NOS较多分布（图1）。在窝轴螺旋动脉, 主要分布在血管内膜（图1、 2）。耳蜗各转Corti器中毛细胞及支持细胞可见二者分布（图1）。另外, 螺旋缘（沟状垫）亦可见二者分布（图1、 2）。前庭膜及盖膜均无分布（图1）。可见耳蜗各转神经节细胞及其相应神经纤维束分布量较多, 有少数单纯绿色荧光为主的神经细胞（图2）。

　　3  讨论

　　有研究认为, NO主要通过上调第2信使cGMP的表达, 使平滑肌细胞内平滑肌纤维舒张, 从而扩张SMA[3]。已知ANP主要通过与ANP受体相结合后催化胞膜型鸟甘酸环化酶（GC）产生大量cGMP, 从而影响离子通道、 蛋白激酶等, 发挥相应信号调节功能[4]。Rachel等[5]研究发现ANP可增加前庭的血流量, 并有剂量依赖性, 同时ANP的舒张血管作用也依赖于cGMP。血管纹ANP和NOS的大量分布, 提示ANP和NO可能在此处发挥对局部血流量及蜗管中内淋巴液平衡的调控作用。螺旋韧带ANP和NOS共同分布, 说明ANP和NO可能作用于螺旋韧带引起局部微结构变化, 而参与局部体液平衡及内淋巴的调节过程。在Corti器中的Corti淋巴与外淋巴成份相似, 因支持细胞间的紧密连接而与内淋巴分隔。

　　图1  ANP和NOS在耳蜗的分布（间接免疫荧光染色, ×200）（略）

　　A: Cy3标记（NOS分布）, B: FITC标记（ANP分布）, C: Cy3、 FITC双标记（红色荧光示NOS分布, 绿色荧光示ANP分布, 黄色荧光为二者共表达）.

　　图2  ANP和NOS在螺旋神经节的分布(间接免疫荧光染色, ×200）（略）

　　A: Cy3标记（NOS分布）, B: FITC标记（ANP分布）, C: Cy3、 FITC双标记（红色荧光示NOS分布, 绿色荧光示ANP分布, 黄色荧光为二者共表达）.

　　本实验中我们观察到在支持细胞和螺旋缘均可见NOS和ANP分布, 此结果显示NO和ANP可能通过调节支持细胞膜电位, 或通过改变细胞骨架形态而影响细胞间隙进而影响内淋巴的代谢[3, 5]。Sabrane等[6]认为, ANP通过引起内皮释放NO而发挥血管扩张作用。Madhani等[7]研究发现: 大动脉和肠系膜小动脉ANPcGMP通路受NOcGMP水平调节, 同时内皮源性NO的释放受局部ANP浓度的影响。可以说, ANP是通过其特有的方式影响NO的合成和释放, 并通过NO的介质作用, 至少部分通过NO作用, 参与血管舒张, 排钠利尿等调节作用。但ANP和NO在耳蜗血流调节和内淋巴生成调节中的相互作用机制尚不明确, 仍需进一步研究。已有研究证实NO作为一种非经典神经递质发挥着信息传递等作用[3]。ANP是多肽类信号分子,也发现在中枢神经广泛分布, 提示其在神经信号传递中可能有一定的作用。对谷氨酸（glutamic acid, Glu）的研究认为, Glu主要从突触前膜释放, 引起突触后膜去极化、 Ca2+内流, 从而激活NOS, 催化产生NO; NO再与胞内型GC结合, 上调cGMP水平, 进而发挥信号传递的作用[8]。NO与ANP都会引起胞质内cGMP及Ca2+浓度的改变[9], 从而影响ATP敏感的K+通道, 改变细胞膜电位水平, 提示其二者可能参与毛细胞兴奋性的调控, 参与Glu介导的听觉神经传入等过程。蜗神经节细胞和轴突可见NOS分布, 说明NO在听觉传递中有重要作用。同时实验观察到在蜗神经节细胞ANP大量分布, 提示ANP可能在神经细胞水电解质平衡或者信号传递中也有重要作用。实验中存在ANP阳性表达为主的神经细胞, 高度提示ANP在神经传递过程中具有独特的作用。因此, 神经节细胞中的ANP是否由神经细胞自己生成, ANP在神经细胞中是否存在重要功能仍需进一步研究。总之, NOS和ANP在耳蜗组织中分布广泛, 且分布位置相似, 提示二者在耳蜗局部血流调节、 淋巴液平衡、 微环境调节以及神经信号传导中有较为重要的作用, 但对于它们之间潜在的相互影响机制目前尚不明确, 仍需进一步的研究。

　　参考文献:

　　[1] 李学昌. 一氧化氮、 一氧化氮合酶及其与内耳的关系[J]. 国外医学・耳鼻咽喉科学分册, 2000, 24(3): 160-164.

　　[2] 陈合新, 史剑波, 邱建华, 等. 心钠素免疫反应在豚鼠耳蜗中的整体分布[J]. 中国临床解剖学杂志, 2002, 20(4): 290-291.

　　[3] Si JQ, Zhao H, Yang YQ, et al. Nitric oxide induces hyperpolarization by opening ATPsensitive K channels in guinea pig spiral modiolar artery[J]. Hear Res, 2002, 171: 167-176.

　　[4] Garg R, Pandey KN. Regulation of guanylyl cyclase/natriuretic peptide receptorA gene ex[x]pression[J]. Peptides, 2005, 26(6):1009-1023.

　　[5] Rachel JD, Dziadziola JK, Quirk WS. Atrial natriuretic peptide participates in the regulation of vestibular blood flow[J]. Hear Res, 1995, 89(1-2): 181-186.

　　[6] Sabrane K, Gambaryan S, Brandes RP, et al. Increased sensitivity to endothelial nitric oxide (NO) contributes to arterial normotension in mice with vascular smooth muscleselective deletion of the atrial natriuretic peptide (ANP) receptor[J]. J Biol Chem, 2003, 278(20): 17963-17968.

　　[7] Madhani M, Scotland RS, MacAllister RJ, et al. Vascular natriuretic peptide receptorli[x]nked particulate guanylate cyclases are modulated by nitric oxidecyclic GMP signalling[J]. Br J Pharmacol, 2003, 139(7): 1289-1296.

　　[8] Simard M, Nedergaard M. The neurobiology of glia in the context of waterandionhomeostasis[J].Neuroscience,2004, 129(4):877-896.

　　[9] 韩  捷, 范  云. 整合素信号对离子通道的影响[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2002, 18(6): 662-663.

　　基金项目: 国家自然科学基金资助项目（39200133）

　　（第四军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科, 陕西 西安 710032）

作者：王剑, 乔莉, 邱建华