细胞移植中的基因修饰技术

　　基因治疗的发展已经取得了可喜的成果--将实验研究成果转化为临床治疗。基因修饰技术已被大量运用于细胞移植，但瓶颈是有效的基因传递系统。几种病毒载体已被用于转导终末期的分化细胞，近来的大部分成功的案例都是应用腺病毒相关载体。作为一种替代方法，人类胚胎干细胞和干细胞样体系已被建立用来产生组织特异性的基因修饰细胞。由于这些细胞在遗传操作和自我更新能力上的可行性，它们可以用来进行大规模的体外生产。这种体外细胞培养系统将为再生医学提供足够数量的高纯度的自体免疫细胞。

　　细胞移植已被证明是一种有效的可以治疗多种疾病的方法，包括糖尿病，血液和中枢神经系统（ CNS ）疾患等。其中显著的进步是已经实现了胰岛、骨髓和造血干细胞移植以及免疫疗法。大多数疾病都与参与调节生理稳态的多种因子有关，如生物合成细胞因子，生长因子以及抗凋亡因子等。尽管药物生产商已做了大量的努力来控制这些因子，但根据临床分析治疗这些疾病的途径仍然是完全替代这些病变细胞，尤其是导入基因改造成分进入细胞以刺激或抑制那些涉及到发病机制的因子的表达，这将是一个非常有前景的治疗方法。基因转移可以被定义为一种将有关遗传物质转移到未分化的体细胞（体外或体内）以治疗人类疾病的方法。基因疗法的优势是引入的治疗基因在单一干预和局部表达后会产生一个长期的药效，而系统给药法则会产生负面作用。体外基因转移可将基因导入活细胞，与体内基因送递相比，体外基因转移能赋予宿主细胞内目的基因的限制性表达优势，而不会干扰正常的细胞或组织。因此，体外基因操作比体内操作，因为在体外细胞是有针对性的进行处理，从而避免了转入基因在其它细胞内的不可预见的异位表达。

　　细胞移植联合基因修饰大大加强了治疗效果，由于其具有有效性，特异性和安全性。本文着重讨论基因转移技术中所用到的载体以及它们的局限性。人类基因转移的一个重要应用领域是移植代谢活跃的细胞，例如肝细胞或胰岛。这些细胞分裂的非常慢，因此所使用的基因转移载体要求能够转导静止期细胞。基因转移策略的关键是实现治疗基因到移植细胞的高效率传递。在基因传递策略上已经进行了大量的研究，包括病毒和脂质体转移、电穿孔以及直接DNA注射。近提出的将目的基因转移到分化细胞的方法主要是利用细胞的高增殖能力，如胚胎干细胞（ ES细胞），这是因为ES细胞通过基因转移技术后可以直接分化成所需要的细胞。基于近期的这些发展动态，我们以后将重点关注细胞移植和基因修饰中的技术方法。

基因修饰病毒技术

　　生物病毒作为一种基因转移载体已被广泛地利用和研究。到目前为止，反转录病毒、慢病毒、腺/疱疹病毒和腺相关病毒已作为载体参与基因转移。病毒载体可以非常有效地转导细胞（体内和体外）。一般情况下，重组病毒载体是由治疗基因部分取代病毒基因组而产生的，并提供病毒复制和包装的编码序列。通过转染含有治疗表达盒的病毒载体质粒和含有复制和包装编码序列的质粒，细胞可在培养过程中不断产生病毒颗粒。在研究那些可以产生非常纯的且具有足够滴度的病毒载体系统方面已经取得了一定的进展。图1描述了病毒的生产过程以及病毒到细胞的递送过程。

逆转录病毒载体

　　初，逆转录病毒载体是从γ-逆转录病毒发展而来的，主要是莫洛尼鼠白血病病毒（MoMuLV）。重组逆转录病毒载体是由一个治疗性表达盒组成，该表达盒两侧是两个长末端重复序列，可以提供包装、反转录和整合信号。逆转录病毒在迅速分化的细胞中有很强的感染力，且所转入基因可以长期表达，这是由于前病毒DNA整合到了细胞基因组中并在随后的细胞后代中稳定的表达。到目前为止，逆转录病毒载体是转基因治疗免疫缺陷疾病、血液和中枢神经系统紊乱疾病中广泛应用的载体。由于基因在转移到干细胞后具有高的增殖能力，因此逆转录病毒载体可望用于治疗遗传性单基因失调症，如严重联合免疫缺陷病（SCIDs）。然而，成年细胞却具有低的增殖能力，因此刺激这些细胞的增殖是利用逆转录病毒成功地进行感染而达到治疗目的关键。

　　逆转录病毒介导的基因转移已经成功地用于临床治疗SCID-X病人。近，在SCID-X治疗的临床试验中，已经实现了由逆转录病毒将治疗基因转移到定向造血干细胞中。但是，该方法的长期治疗结果及其副作用还有待界定。关于利用逆转录病毒载体治疗糖尿病，已有了利用该载体成功地转导胰岛的报道。可能是因为逆转录病毒对非分化细胞的低侵染力，完整的胰岛细胞和胎儿胰岛样细胞簇不能被逆转录病毒有效地感染。暴露于肝细胞生长因子/离散因子以及胰岛细胞的分散能够帮助改善逆转录病毒载体的感染效率。NOD小鼠造血干细胞在体外经携带有前胰岛素II的逆转录病毒转导后可以以一种抗原特异性的方式防御破坏性自身免疫胰岛炎。人类骨髓基质干细胞(hMS)在体外被一个携带有胰岛素cDNA片段的逆转录病毒载体转导后，表达的胰岛素可以通过RT-PCR和免疫染色进行检测，且分泌的胰岛素可以在细胞中存留三个多周。因此，被感染的干细胞提供了一个可用来治疗糖尿病的移植细胞来源。

　　逆转录病毒除了成功地转导干细胞外，还可以转移治疗基因到免疫细胞，表皮干细胞，成骨细胞，软骨细胞，神经细胞，内皮祖细胞，骨骼肌肌肉源干细胞，并且取得了一定的成功。逆转录病毒载体由于可以大大降低插入突变的风险而在将来基因治疗的临床试验中越来越受到青睐。

基于慢病毒的载体

　　慢病毒属于逆转录病毒的子类，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)，猫免疫缺陷病毒(FIV)，马传染性贫血病毒(EIAV)，此类病毒能够感染非分裂细胞并且具有较高的效力。没有复制能力的慢病毒属病毒的产生机理与其他病毒的产生几乎相同。来自HIV 的gag 和 pol基因，或rev基因都是慢病毒复制所必需的。病毒颗粒由来自其他病毒的包膜蛋白所包裹，如水泡性口腔炎病毒G蛋白(VSV-G)。VSV-G包膜蛋白使慢病毒粒子成为广谱敏感细胞型。完全缺失HIV致病基因赋予慢病毒介导的基因转移很高的安全性，从而不用担心HIV的致病性。类似于逆转录病毒载体，基于慢病毒的载体能够整合到受体细胞的基因组中，从而使转入的基因能够在体外稳定的表达。这些载体可携带多达9kb的外源基因，并且已经成功的将基因转移到肌细胞、造血干细胞，神经细胞及胶质细胞中。

　　移植转导细胞到链唑霉素诱导的患糖尿病的SCID小鼠可以降低非空腹血糖水平，因此可望成为治疗糖尿病的有效途径。携带有报告基因的慢病毒可以使胰岛在正电子发射断层扫描(PET）检查中被检测到。体内微PET跟踪监测小鼠胰岛移植显示慢病毒载体具有很高的转导效率，从而提供了一种监测胰岛移植存活情况的技术。葡萄糖激发后维持转导胰岛中胰岛素的分泌，使糖尿病小鼠的血糖水平正常化，以及转导胰岛中的基因长期持续的表达这些都验证了慢病毒载体转导胰岛的功效。

　　不同的包膜糖蛋白可能对完整的胰岛有不同的感染效力。淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）的包膜糖蛋白已被证实在转导效率和转导胰岛的功能上要优于其它包膜糖蛋白。只有30 ％的完整胰岛细胞可在体外被慢病毒转导而不会有效地感染位于胰岛中心的产胰岛素细胞。然而，整个胰腺灌注法大大改善了转导效率，并能使位于胰岛中心细胞内的转基因获得高度表达，并能保护胰岛的完整结构。由于冷冻保存的人胰岛并不影响慢病毒的转导效率，因此整个胰腺灌注法将有利于慢病毒介导的基因转移的临床应用。这种病毒能有效地转导完整胰岛中的胰脏β细胞，并确保外源基因能稳定表达，它在完整胰岛中的转导效率能够达到与腺病毒的相似的水平。然而，由于慢病毒载体主要源于艾滋病毒，因此这些载体的安全性仍然是公众和科学团体关注的焦点。而野生型的FIV, EIAV和绵羊髓鞘脱落病毒（Visna viruses）对人类似乎不致病， 发展非基于HIV的慢病毒与趋向于胰岛的假包膜蛋白可以延伸由慢病毒介导的基因转移胰岛的适用性。类似于逆转录病毒载体，慢病毒载体也是一个整合载体，将载体基因组整合到受体基因组中可以为持久改善遗传性疾病提供一个长期的转基因表达量。然而，整合可能会影响到内源性基因的表达，内源基因的活性也可能刺激或抑制转入基因的表达，也就是说，整合表达盒可被内源性转录因子或增强子所控制。因此，通过对病毒整合的控制可以提高慢病毒载体的安全性。

腺病毒载体

　　腺病毒（AdV）载体是一种很好的病毒载体，可将基因转移到代谢活跃且具有低增殖能力的细胞中，如胰脏胰岛细胞。AdV载体具有较高的装载量，可以提供约30kb的外源基因，可以传递一个以上的基因治疗表达盒，因此含有转录增强因子的治疗性基因和其他协同基因可以同时进行转导。此外，高滴度的AdV载体可以很容易地生产，这对进行体内转导需要大量的病毒是非常有价值的。然而，AdV可以触发强烈的免疫反应，并且转入基因的表达往往很短暂，这是由于它们在细胞中是以非整合的形式存在。目前已有大量的研究证实了成功地使用AdV转导胰岛胰脏β细胞。到目前为止，转录因子、炎症因子、生长因子、分化因子和抗凋亡因子都已经成功地经AdV载体转导进胰岛中。另外，还有一些研究报道了改良的AdV载体，这些改良的载体可以在离体的胰岛中产生高速的转导效率。尽管如此，体外AdV感染胰岛只能转导30～40％的胰岛细胞，其中大部分位于胰岛的外周。这与慢病毒属的结果相一致。胶原酶处理后，转导效率可以提高到70 ％ ，但是胶原酶处理后葡萄糖激发的胰岛素释放功能受到损伤。原位动脉输注AdV粒子到胰岛中可以提高转导效率至90 ％，而没有危害胰岛功能。这一灌注方法表明了使用AdV和慢病毒转导胰岛的一致性和高效率性，因此可以延伸临床治疗中基因疗法的应用。用以增加转导持久性的全滴剂AdV载体的发展以及免疫抑制的使用将大大改善AdV介导的基因转移的效力。

　　疱疹病毒（ HSV ）载体，也可以装载较大的外源基因，但转入基因的瞬时表达限制了这些载体在基因疗法中的应用。研究显示人胰岛细胞被携带有抗凋亡基因bcl-2的HSV载体转染后能阻止细胞因子诱生的免疫反应以及体外胰岛细胞的死亡。HSV载体的进一步发展可以延伸它在基因疗法中的应用。

腺相关病毒载体

　　腺相关病毒（AAV）是细小病毒科家族的一员。它是一个单连的，复制缺陷型的DNA病毒；由两个基因组成，可以编码四个复制蛋白和三个衣壳蛋白。该病毒基因组的两侧是两个145bp的反转末端重复序列（ITR）。野生型2型AAV能借助其 rep基因整合病毒基因组到人第19号染色体的某一特定位点。AAV似乎并未在人体内引起疾病；AAV介导的外源蛋白可以表达,这是由于AAV具有较低的免疫反应，缺乏触发破坏性的细胞毒性淋巴细胞抵抗转导细胞的能力从而使病毒基因组持久存在在细胞中。此外，AAV还能高效转导分化和非分化的细胞。重组AAV（ rAAV）是通过将治疗表达盒（加边以完整的顺式作用ITR序列）替代野生病毒基因组而构建的。病毒感染后，rAAV可以实现转基因的持续表达，由于在rAAV中缺少rep 基因，因此它不能整合到宿主细胞的基因组中，但大多数研究表明，rAAV在细胞核里有一个稳定的遗传形式，从而能够长期存在和并能使转基因持久表达。虽然rAAV看起来是基因转移的佳病毒载体，但AAV仍存在缺点那就是转基因的能力有限，它不能有效地装载超过4.7 kb的外源基因。利用基于AAV的载体可以将治疗基因转移到宿主细胞用来治疗糖尿病。人体骨髓基质干细胞被携带有可分解碱性氨基酸蛋白酶的人前胰岛素原基因的AAV载体转导后可以分泌胰岛素并且不会损伤细胞的存活力。

　　由AAV介导的转基因表达的限速步骤是转换单链DNA为双链DNA，从而使转录可以正常进行。近，以双链AAV（ dsAAV ）为基础的载体已经研制成功，它表现出比常规单链AAV (ssAAV)更高的转导效率，因为它在细胞内不用进行单双链转变。dsAAV载体可以使外源基因在胰岛中持续表达至少个月，而不会引起免疫反应和损害胰岛功能，如葡萄糖响应性，生存力及胰岛素含量。由于插入限制，dsAAV载体只能装载ssAAV载体所能装载的一半大小的外源基因。关于在胰岛移植中由AAV介导的基因转移，有关防止免疫反应从而延长移植体的生存能力的策略正在开发，其中包括免疫细胞激活及免疫调节。免疫调节是通过传递细胞因子来实现的，如白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10），从而对移植胰岛产生细胞保护作用。

　　血清型可能对胰岛有不同的偏爱性， AAV2是转导人胰岛的佳选择，AAV1则能更有效率地感染小鼠胰岛。AAV8可以通过体内传递而使转基因有效地表达。我们在研究AAV载体时，使用了与研究AdV载体相似的载体修饰策略，引进脱辅基蛋白E（ApoE）基因可以增强AAV转导胰岛细胞和肝细胞的靶向作用，这两种细胞均可以表达低密度的脂蛋白受体。与使用野生型AAV2载体相比，它可以使胰岛转导效率增加200倍，肝细胞转导效率增加4倍。目前，随着对双链AAV载体的不断研究，长度大于6kb的外源基因能够有效地进行传递，这就促进了由AAV介导的胰岛移植中基因修饰技术的发展。

非病毒基因转移载体

　　虽然病毒载体能够有效的转导细胞，但病毒基因在体内的转录以及这些基因整合到宿主基因组中的风险仍然存在。此外，病毒颗粒的生产需要专业的技能和人员。非病毒载体，如质粒，是很容易得到的，并且可以经脂质体转移或电击法而递送到细胞中，对人体也是安全的。利用非病毒载体成功地转染细胞，尤其是阳离子脂质，已经在胰岛移植中得以实现。通过阳离子脂质来实现治疗基因转导胰岛的体外操作已经在猪胰岛细胞中建立。后来的有关利用阳离子脂质转移血管内皮生长因子（VEGF）到胰岛的研究表明进行体外转染可以保护胰岛的功能和生存力并能提高移植胰岛的存活力。而通过脂质体将白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1ra）基因导入胰岛细胞中却只能引起IL-1ra的短期表达，这是不足以提供移植胰岛的保护的。电穿孔技术可以用来传递核酸片段、寡核苷酸、小分子干扰核糖核酸（siRNA）以及质粒到细胞中。已经完成了对体内电穿孔技术的研究，但是电击通常会对分化的成年细胞造成伤害。由于非病毒基因转移在很多案例中表现出的低效率或者造成严重的膜损伤，因此发展安全高效的非病毒载体以作为新一代的基因治疗载体将是非常有益的。

　　非病毒基因转移的理想宿主细胞是具有增殖能力和自我更新潜能的细胞。因此，胚胎和成年干细胞被看作是非病毒技术的重要细胞来源，由于它们可以原位产生大量的细胞且具有高的移植力和繁殖力，因此在细胞替代疗法中有着显著的优势。

细胞来源

　　胚胎和成年干细胞已被看作是细胞替代疗法中的主要细胞来源。但是在再生医学上应用人胚胎干细胞（hES）受到一些伦理和法律的限制，因此成年干细胞成为一个很有吸引力的选择，因为它们不存在上述问题并且自体移植是可行的。然而，这些细胞似乎并不具有多潜能性。因此，我们将重点放在转基因修饰胚胎干细胞和胚胎干细胞样的体系上，以便在体外生产它们的可移植的组织特异性诱导物。

　　由于转基因操作的可行性， ES细胞有望成为一个很有前景的细胞来源，并且满足下列要求：(1)大量的目标细胞将传递给罹病者并确保显著的治疗效果。(2)用于移植的组织特异性细胞培养物必须从未分化的高致瘤性胚胎干细胞中完全纯化出来。(3)供体细胞必须具有很高的移植能力和存活能力，好能够增生以恢复受赠器官的功能。 (4)移植细胞应当具有自体免疫能力。

　　细胞移植之前对其进行基因修饰是获得理想治疗效果的有效途径。病毒和非病毒基因转染技术已经取得了显著进步，甚至可以根据病人的需要定制特定的移植细胞。大规模生产适合于无畸胎瘤细胞移植的纯化的组织特异性细胞仍然对胚胎干细胞样的体系和成年细胞有效。到目前为止所确立的方法以及将来发展出来的新方法都会大大促进细胞移植中基因修饰技术的发展。

【编 辑:侯 婷】