缺血预适应诱导PKCα、PKCε活化和失血性休克大鼠血管反应性和钙敏感性保护的机制

　徐竞,李涛,杨光明,刘良明 作者单位：国家重大基础研究计划项目973项目(2005CB522601);国家杰出青年科学基金(30625037) 400042重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所二室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室

　　【摘要】目的 观察缺血预适应是否通过腺苷受体，诱导蛋白激酶Cα (protein kinase Cα,PKCα)、蛋白激酶Cε(protein kinase Cε,PKCε)活化和失血性休克大鼠血管反应性和钙敏感性保护。方法 采用高效液相色谱法测定缺血预适应过程中腺苷浓度变化;采用western blot技术，观察A1、A2A、A2B、A3腺苷受体(A1、A2A、A2B、A3 adenosine receptor，A1R、A2AR、A2BR、A3R)抑制剂对缺血预适应诱导PKCα和PKCε表达和转位的影响;采用离体微血管环张力测定技术，观察腺苷受体抑制剂对缺血预适应诱导失血性休克血管反应性和钙敏感性保护作用的影响。结果 (1)休克2小时后血浆腺苷浓度较正常对照组显著增高，5%失血量预适应可进一步增高休克后的血浆腺苷浓度，以在休克前30分钟缺血预适应组的腺苷浓度高(P<0.01);(2)5%失血量休克前30分钟预适应可促进PKCα和PKCε由胞浆向胞膜的转位(P<0.01)，A1R拮抗剂可显著抑制缺血预适应导致的PKCα和PKCε的转位，使PKCα的胞膜/胞浆部分比值分别由1.071回降至0.583，使PKCε的胞膜/胞浆部分比值由1.280回降至0.606(P<0.01)，A2AR、A2BR和A3R拮抗剂没有明显作用;(3)5%失血量休克前30分钟预适应可诱导血管反应性和钙敏感性的保护作用(P<0.01)，A1R拮抗剂可以显著抑制其保护作用，使去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)和Ca2+的大收缩力(Emax)分别降低59.3%和53.4%(P<0.01)，A2AR、A2BR、A3R拮抗剂均无显著抑制作用。结论 缺血预适应通过A1R，诱导PKCα和PKCε活化和失血性休克大鼠血管反应性和钙敏感性的保护。

　　【关键词】 失血性休克;缺血;血管反应性;钙敏感性;腺苷受体

　　【Abstract】 ob[x]jective To observe the role of adenosine receptor in the ischemia preconditioning-induced activation of protein kinase Cα(PKCα),protein kinase Cε(PKCε) and protection of vascular reactivity and calcium sensitivity after hemorrhagic shock in rats.Methods The changes of adenosine concentration after ischemia preconditioning were measured using high performance liquid chromatogram(HPLC) system. The effects of A1,A2A,A2B and A3 adenosine receptor(A1R,A2AR,A2BR and A3R) inhibitors on the protein ex[x]pression and translocation of PKCα and PKCε induced by ischemia preconditioning were measured via western blot, and the effects of A1R,A2AR,A2BR and A3R inhibitors on the protection of vascular reactivity and calcium sensitivity after hemorrhagic shockinduced by ischemia preconditioning were measured via isolated organ perfusion system.Results (1)The adenosine concentration was significantly increased after 2 hours shock comparing with normal control. Ischemia preconditioning could further increase the adenosine concentration after shock, and the adenosine concentration of 5% hemorrhage applied at 30 minutes before shock group was the highest(P<0.01).(2)Ischemia preconditioning (5% hemorrhage applied at 30 minutes before shock) could promote the translocation of PKCα and PKCε from cytoplasm to membrane(P<0.01),which was inhibited by A1R inhibitor. The ratio of PKCα protein ex[x]pression in membrane to that in cytoplasm was decreased from 1.071 to 0.583,and the ratio of PKCε protein ex[x]pression in membrane to that in cytoplasm was decreased from 1.280 to 0.606(P<0.01).A2AR,A2BR and A3R inhibitors had no effects.(3)Ischemia preconditioning (5% hemorrhage applied at 30 minutes before shock) could induce the protection of vascular reactivity and calcium sensitivity after hemorrhagic shock, which was also inhibited by A1R inhibitor. The Emax of NE and Ca2+ were decreased by 59.3% and 53.4% respectively(P<0.01).A2AR,A2BR and A3R inhibitors had no effects.Conclusion Ischemia preconditioning could induce the activation of PKCα,PKCε and the protection of vascular reactivity and calcium sensitivity after hemorrhagic shock in rats through A1R.

　　【Key words】hemorrhagic shock;ischemia;vascular reactivity;calcium sensitivity;adenosine receptor

　　本实验室前期研究发现，蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)、蛋白激酶Cε(protein kinase Cε,PKCε)是参与失血性休克后大鼠血管反应性和钙敏感性调节的主要PKC亚型，也是失血性休克后血管反应性的重要内源性保护分子[1-2]。缺血预适应(5%失血量休克前30分钟预适应处理)可通过诱导PKCα和PKCε的转位和活化，发挥对失血性休克后血管反应性和钙敏感性保护作用。而缺血预适应诱导PKCα和PKCε转位和活化的机制如何，目前尚不清楚。腺苷是参与心脏缺血预适应的重要分子，而腺苷是否也参与了缺血预适应诱导的PKCα和PKCε转位和活化以及对血管反应性和钙敏感性的保护?血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)膜上有A1、A2A、A2B、A3腺苷受体(A1、A2A、A2B、A3 adenosine receptor，A1R、A2AR、A2BR和A3R)，哪种腺苷受体类型参与其中?目前尚不清楚。本实验采用高效液相色谱法、Western blot技术以及离体微血管环张力测定技术，观察缺血预适应过程中腺苷浓度变化，A1R、A2AR、A2BR及A3R抑制剂对缺血预适应诱导PKCα和PKCε表达和转位的影响，以及对缺血预适应诱导的保护作用的影响。探讨缺血预适应诱导PKCα和PKCε活化和失血性休克大鼠血管反应性和钙敏感性保护是否与腺苷有关，并明确参与的腺苷受体类型。

　　材料与方法

　　1 实验动物处理

　　清洁级Wistar大鼠，80只，雌雄各半，体重220～230g。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，右侧股动脉插管接血压计，随机将8只大鼠作正常对照，8只大鼠制作失血性休克模型(40mmHg，2小时)，其余大鼠进行5%失血量休克前不同时间缺血预适应处理(休克前30分钟、1、2、3小时缺血预适应处理，休克前30分钟组40只，其余组各8只大鼠)，再制作失血性休克模型。休克2小时完成后，抽取动脉血测定血浆腺苷浓度。再活杀大鼠取肠系膜上动脉(superior mesenteric artery，SMA)一级分支，制成约2.5mm长的微血管环。将5%失血量休克前30分钟预适应组的血管环再分作4个亚组：A1R拮抗剂组、A2AR拮抗剂组、A2BR拮抗剂组、A3R拮抗剂组，测定血管反应性和钙敏感性，将SMA主干及其余分支用于测定PKCα和PKCε的胞浆和胞膜蛋白表达。

　　2 血浆腺苷浓度测定

　　取大鼠动脉血，3500r/min于4℃离心10分钟，取上清即为血浆。取血浆200μl加入三蒸水100μl、乙腈400μl，静置10分钟，3500r/min于4℃离心10分钟，取上清20μl，用高效液相色谱仪和反相300SBC3 柱 (4.6×250mm)检测吸光度，流动相为甲醇：0.1%三氟乙酸(TFA)(60%)，流速1ml/min，波长260nm。先用不同浓度的腺苷标准品(Sigma，0.5、1、5、10、20、40mg/L)绘制标准曲线，再对照标准曲线得出样品血浆的腺苷浓度(单位：mg/L)[3]。

　　3 PKCα和PKCε在胞浆和胞膜表达的检测

　　取经过缺血预适应和给药处理的大鼠SMA组织[A1R拮抗剂组加入1×10-6mol/L DPCPX孵育10分钟，A2AR拮抗剂组加入1×10-7mol/L SCH58261孵育10分钟，A2BR拮抗剂组加入5×10-8mol/L MRS1754孵育10分钟，A3R拮抗剂组加入1×10-7mol/L MRS1523孵育10分钟]，加入200μl胞浆蛋白提取液(TrisHCl 20mmol/L，pH 6.8,EDTA 2mmol/L，EGTA 1mmol/L，β巯基乙醇0.1%，NaF 10mmol/L，Na3VO4 1mmol/L，PMSF 1mmol/L，leupeptin 20mmol/L，aprotinin 50μg/mL)，于玻璃匀浆器置于冰上匀浆10分钟后，离心1000×g，4℃ 10分钟，取上清离心16000×g，4℃，30分钟，上清即为胞浆蛋白成分;沉淀加入100μl胞膜蛋白提取液(含1% Triton X100和0.1% SDS的胞浆蛋白提取液)，反复吹打后于4℃摇床平缓摇动1小时，离心16000×g，4℃，20分钟，取上清液即为胞膜蛋白成分。采用二喹林甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法蛋白定量，常规Western blot技术检测胞浆和胞膜蛋白中PKCα和PKCε的表达[4]。

　　4 血管环血管反应性和钙敏感性测定

　　将微血管环固定在微血管肌动描记仪上，浸入KrebsHenseleit(KH)液中，根据Power Lab系统计算结果给予初始张力，在KH液中平衡微血管环，直至张力曲线趋于水平。再根据实验组的要求进行给药处理，A1R拮抗剂组加入1×10-6mol/L 8cyclopentyl13dipropylxanthine孵育10分钟，A2AR拮抗剂组加入1×10-7mol/L SCH58261孵育10分钟，A2BR拮抗剂组加入5×10-8mol/L MRS1754孵育10分钟，A3R拮抗剂组加入1×10-7mol/L MRS1523孵育10分钟。处理完毕后，按累积浓度法向浴槽KH液中依次加入梯度浓度NE，记录不同NE浓度下血管环产生的收缩力，作量效曲线。曲线拟合法求NE的大收缩力(Emax)和半数有效浓度负对数(-log[EC50],pD2)，以NE的Emax和pD2以及量效曲线评价血管反应性。将KH液换成髙钾液(组成：NaCl 32.7mmol/L、KCl 90mmol/L、NaHCO325 mmol/L、KH2PO41.03mmol/L、MgSO4·7H2O 0.45 mmol/L、Glucose 11.1mmol/L，pH7.4)，采用累积浓度法检测微血管环对梯度浓度Ca2+的反应性，用Ca2+的量效曲线、大收缩力(Emax)以及pD2评价血管钙敏感性。

　　5 统计学处理

　　所有数据均以±s表示，采用SPSS 10.0统计软件处理,组内自身对照和配对实验数据用t检验，组间比较采用方差分析，P<0.05为显著差异，P<0.01为差异非常显著。

　　结 果

　　1 缺血预适应过程中血浆腺苷浓度变化

　　正常对照大鼠血浆腺苷浓度低，为3.373mg/L，休克2小时后显著增高至7.299mg/L(P<0.01)，5%失血量预处理可进一步增高休克后的血浆腺苷浓度，并随着休克前缺血预适应时间延长逐渐下降，以在休克前30分钟缺血预适应组的腺苷浓度高，为12.794mg/L(P<0.01)，休克前1、2、3小时缺血预适应组的腺苷浓度依次为12.145、9.625、8.762mg/L(图1)。

　　2 腺苷受体抑制剂对缺血预适应诱导PKCα和PKCε表达和转位的影响

　　PKCα：缺血预适应 (5%失血量预适应30分钟)可促进PKCα由胞浆向胞膜的转位，使胞膜/胞浆部分比值由正常对照的0.124增高至1.071(P<0.01)，A1R拮抗剂可显著抑制缺血预适应导致的PKCα转位，使胞膜/胞浆部分比值回降至0.583(P<0.01)，A2AR、A2BR和A3R拮抗剂没有明显作用。

　　PKCε：缺血预适应(5%失血量预适应30分钟)可促进PKCε由胞浆向胞膜的转位，使胞膜/胞浆部分比值由正常对照的0.303增高至1.280(P<0.01)，A1R拮抗剂可显著抑制缺血预适应导致的PKCε转位，使胞膜/胞浆部分比值回降至0.606(P<0.01)，A2AR、A2BR和A3R拮抗剂没有明显作用(图2)。

　　3 腺苷受体抑制剂对缺血预适应诱导的休克血管反应性和钙敏感性保护作用的影响

　　5%失血量预处理30分钟可诱导的对休克2小时后血管反应性和钙敏感性的保护作用，使NE和Ca2+的累积量效曲线左移，Emax分别增高至正常组的86.0%和92.7%(P<0.01)。A1R拮抗剂可以显著抑制5%失血量预处理30分钟诱导的对血管反应性的保护作用，使NE的累积量效曲线右移，Emax降低59.3%(P<0.01)，pD2值无明显变化;A1R拮抗剂还可以显著抑制5%失血量预处理30分钟诱导的对血管钙敏感性的保护作用，使Ca2+的累积量效曲线右移，Emax降低53.4%(P<0.01)，pD2值无明显变化，A2AR、A2BR和A3R拮抗剂均无明显作用(图3)。

　　讨 论

　　本实验室前期研究发现，缺血预适应(5%失血量预适应30分钟)可通过诱导PKCα和PKCε的转位和活化，发挥对失血性休克后血管反应性和钙敏感性保护作用。而缺血预适应诱导PKCα和PKCε转位和活化的机制如何，目前尚不清楚。

　　目前关于缺血预适应保护机制研究较多的是在心脏中，多种膜受体介导了缺血预适应的信号转导，包括腺苷、嘌呤、内皮素、乙酰胆碱、α1和β肾上腺素能、血管紧张素Ⅱ、缓激肽、类阿片等受体，其中起主要作用的是腺苷受体[5]。在心肌细胞膜上，有A1R、A2AR、A2BR及A3R 4种腺苷受体 (adenosine receptor,ARs)，腺苷受体活化后，可经A1R通过G蛋白活化磷脂酶C(PLC)，经A3R通过G蛋白活化磷脂酶D(PLD)，释放三磷酸肌醇(inositol 1,4,5xrisphophate,IP3)和二脂酰甘油(diacylglycerol,DAG)，直接激活PKC，诱导心肌的预适应保护，PKC抑制剂可阻断这几种受体激动剂介导的保护作用[6-7]。

　　目前已经证实在VSMC膜上也有A1R、A2AR、A2BR及A3R 4种腺苷受体，但腺苷及其受体在血管舒缩功能预适应保护中的作用研究很少。有关的文献报道，在缺血再灌注损伤的小鼠冠状动脉，对血管内皮依赖的舒张剂二磷酸腺苷(aderosine diphosphate,ADP)反应性降低，应用A1R激动剂CHA(50nmol/L)不能改善冠状动脉功能，但A1R抑制剂DPCPX可以加重舒张反应性降低，应用A3R激动剂ClIBMECA可以部分恢复舒张反应性，但其抑制剂 (100nM MRS1220)对冠状动脉功能没有作用，A2AR抑制剂(100nM SCH58261)以及A2BR抑制剂(50nM MRS1754)对冠状动脉功能均没有作用，提示A1R和A3R可以介导对缺血再灌注损伤的小鼠冠脉舒张反应的保护[8]。在猪冠状动脉，A1R激动剂ENBA(10-9mol/L) 可诱导对冠脉收缩反应的保护，显著增高冠脉对内皮素1(endothetin1，ET1)的收缩反应性，减弱PDBu导致的对ET1的收缩反应性下降，并增高PKC蛋白表达水平，A1R抑制剂N0861可消除ENBA的保护作用。A2R激动剂CGS 21680对ET1诱导的收缩反应性没有作用，A2R抑制剂DMPX可增强对ET1的收缩反应性，但对PKC的表达没有作用，进一步研究发现，A1R是通过抑制型G蛋白(Gi)和其他G蛋白(Go)调节PKC表达。提示腺苷可诱导冠脉收缩反应性的保护，并与通过Gi和Go蛋白诱导PKC表达有关[9]。

　　缺血预适应是否通过腺苷受体诱导血管PKCα、PKCε转位和活化，以及对休克血管反应性和钙敏感性的保护，哪些腺苷受体在其中起重要作用?尚不清楚。我们的实验发现休克2小时后血浆腺苷浓度较正常对照组显著增高，5%失血量预处理可进一步增高休克后的血浆腺苷浓度，并随着休克前缺血预适应时间延长逐渐下降，以在休克前30分钟缺血预适应组的腺苷浓度高。5%失血量休克前30分钟预适应可促进PKCα和PKCε由胞浆向胞膜的转位，并诱导对血管反应性和钙敏感性的保护作用，A1R拮抗剂可显著抑制缺血预适应导致的PKCα和PKCε的转位、及其诱导的对血管反应性和钙敏感性的保护作用，A2AR、A2BR及A3R拮抗剂均无显著抑制作用。提示缺血预适应可以通过A1R，诱导PKCα和PKCε活化及失血性休克血管反应性及钙敏感性的保护。

　　【参考文献】

　　[1]徐竞,杨光明,李涛,等.PKCε对失血性休克大鼠血管反应性和钙敏感性的调节作用[J].中国危重病急救医学，2008,20(3):138-141.

　　[2]徐竞,杨光明,李涛,等.失血性休克大鼠PKCα mRNA表达变化规律及对血管低反应性的调节作用[J].中国急救医学，2009，29(1):46-49.

　　[3]Zhu XH,Jiao JJ,Tang C,et al.Determination of adenosine in plasma in rabbit by HPLC[J].Chin Hosp Pharm J，2006，26(4):437-439.

　　[4]Xu J,Yang GM,Li T,et al.Involvement of CPI17 and ZIPK in the regulation of PKCα,ε on vascular calcium sensitivity following hemorrhagic shock[J].Shock,2010,33(1)：49-55.

　　[5]James MD,Amanda MD,Michael VC.Signaling pathways in ischemic preconditioning[J].Heart Fail Rev,2007,12(3-4):181-188.

　　[6]Cohen MV,Philipp S,Krieg T,et al.Preconditioningmimetics bradykinin and DADLE activate PI3kinase through divergent pathways[J].J Mol Cell Cardiol，2007,42(14):842-851.

　　[7]Cohen MV,Downey JM.Adenosine: trigger and mediator of cardioprotection[J].Basic Res Cardiol,2008,103(3):203-215.

　　[8]Zatta AJ,Matherne GP,Headrick JP.Adenosine receptormediated coronary vascular protection in postischemic mouse heart[J].Life Sciences,2006,78(21):2426-2437.

　　[9]Marala RB,Mustafa SJ.Modulation of protein kinase C by adenosine: involvement of adenosine A1 receptorpertussis toxin sensitive nucleotide binding protein system[J].Mol Cell Biochem,1995,149-150:51-58.