化疗药物对TRAIL在急性白血病原代细胞表达的影响

作者：刘延方,陈胜梅,孙慧,董见喜,张秋堂　　作者单位：郑州大学附属医院血液科，郑州 450052

　　【摘要】为了探讨TRAIL在急性白血病原代细胞表达及化疗药物对TRAIL在急性白血病细胞表达的影响，采集16例初诊的急性白血病患者化疗前、化疗1天后、3天后和5天后的外周血，分离单个核细胞并用流式细胞术检测TRAIL的表达;同时采集12例初诊的急性白血病患者化疗前骨髓，分离单个核细胞进行培养，分别加VP-16和/或干扰素，培养一定时间后检测TRAIL的表达水平。结果表明：与化疗前相比，初治急性白血病患者外周血单个核细胞TRAIL的表达水平在化疗1天后即明显提高(P<0.05);在体外培养实验中，VP-16上调TRAIL在急性白血病骨髓单个核细胞的表达(P<0.05)，VP-16联合干扰素与单独应用VP-16相比，TRAIL的表达水平无差异(P>0.05)。结论：化疗药物治疗白血病的机制之一可能是通过诱导TRAIL的表达而促进白血病细胞的凋亡。

　　【关键词】 急性白血病

　　Abstract In order to explore the ex[x]pression of TRAIL in primary acute leukemic cells and the effect of chemotherapyeutic drug on TRAIL ex[x]pression in acute leukemic cells，the ex[x]pression of TRAIL was assessed by flow cytometry on day 0，day 1，day 3 and day 5 in 16 patients with acute leukemia received chemotherapy. Meanwhile，the bone marrow mononuclear cells of acute leukemia patients were cultured in vitro with VP-16 and INFα-2a. ex[x]pression of TRAIL was analyszed by flow cytometry at 24，48 and 72 hours after treatment. The results showed that the ex[x]pression of TRAIL in the peripheral blood mononuclear cells was upregulated significantly from day 1 after chemotherapy(P<0.05). In in vitro culture test，VP-16 upregulated the ex[x]pression of TRAIL on acute leukemia bone marrow mononuclear cells(P<0.05). Compared with VP-16 alone，the combination of VP-16 with IFNα-2a showed no synergic effects on the ex[x]pression of TRAIL. It is concluded that the ex[x]pression of TRAIL increases after chemotherapy in vivo and after treatment with VP-16 and IFN in vitro，which suggests that the apoptosis induced by TRAIL may play an important role in chemotherapy of leukemia.

　　Key words TRAIL; acute leukemia; chemotherapy drug

　　细胞凋亡是程序性细胞死亡过程，在机体的发生发展及自身稳定中起着关键作用，对肿瘤细胞的生长具有抑制和免疫监视作用。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是TNF超家族的新成员，它与其特异性死亡受体结合，激活多种凋亡信号传导途径，诱导细胞凋亡[1]。赵湜等[2]检测了TRAIL及其受体在急性髓系白血病细胞中的表达，发现患者组TRAIL、DR4和DR5表达高。然而，关于化疗药物对TRAIL在急性白血病细胞表达的影响未见报道。本研究应用流式细胞术检测了化疗药物在体内外对急性白血病细胞表达TRAIL的影响，并通过分析平均荧光强度(mean fluorecence intensity，MFI)从分子水平上了解细胞表达TRAIL的变化，旨在探讨TRAIL表达在急性白血病化疗中的意义。

　　材料和方法

　　研究对象及标本处理

　　经细胞形态学、组织化学和细胞免疫学确诊的初诊急性白血病患者16例，急性非淋巴细胞白血病以标准DA或AA方案治疗，急性淋巴细胞白血病以VDCP方案治疗。于化疗前及化疗1、3和5天后取外周血，肝素抗凝，以淋巴细胞分离液(Ficoll，密度1.077)按常规方法分离单个核细胞，并调整细胞浓度为1×107/L;选择其中12例，化疗前取其骨髓10 ml分离单个核细胞后于加有VP-16、干扰素的培养液中培养，取培养前、培养24、48及72小时的细胞，用PBS调整细胞浓度为1×107/L。

　　主要试剂

　　同型对照IgG、PE-TRAIL鼠抗人单克隆抗体(100 μg)和Percp-cy5.5-CD45鼠抗人单克隆抗体，均购自美国Becton Dickinson公司，用前PBS稀释20倍。含20%胎牛血清的TC-199培养液购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

　　细胞培养

　　将分离的急性白血病骨髓单个核细胞在加有VP-16、干扰素的培养液中培养(细胞浓度为1×105/L)，分4组：第1组为空白对照组，第2组加VP-16(终浓度为50 μg /ml)，第3组加干扰素(终浓度为2000 U /ml)，第4组加VP-16和干扰素(药物终浓度同上)。各组细胞均于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内培养。

　　流式细胞分析术

　　初治白血病患者的外周血单个核细胞和培养获得的骨髓单个核细胞分装为2管，试管1加入CD45单克隆抗体及同型对照IgG，试管2加入CD45和TRAIL单克隆抗体，分别加入100 μl细胞悬液，室温避光孵育30分钟，PBS洗涤3次后用流式细胞仪Facstar(美国Becton Dickinson公司产品)检测TRAIL的表达。应用CellQuest软件获取并分析10 000个细胞，以PE-TRAIL为横坐标，细胞数为纵坐标，分析计算细胞群中TRAIL的表达。由于细胞结合抗体的多寡与其荧光强度相关，故以MFI为指标分析细胞表达TRAIL蛋白分子的水平。

　　统计学处理

　　经SPSS (10.0版)统计软件进行统计学分析，统计数据用“均数±标准差”表示，进行配对设计资料t检验，以α=0.05为显著性检验水准。

　　结 果

　　TRAIL在化疗过程中的表达

　　通过观察以CD45/SSG设门识别白血病幼稚细胞后发现，一些患者经过5天化疗后，外周血中白血病幼稚细胞明显减少。由于分析的结果不适宜与化疗3天前的结果进行比较，因此本研究谨以患者外周血单个核细胞为研究对象分析化疗药物对TRAIL表达的影响。初治急性白血病患者的外周血单个核细胞表达TRAIL的水平(MFI)在化疗1天后较化疗前有明显的提高(P<0.01)，以化疗后第3天的增加为显著，此后逐渐下降。但是，TRAIL表达水平在化疗1、3和5天后的变化无统计学意义(P>0.05。

　　VP-16及干扰素在体外对急性白血病骨髓细胞表达TRAIL的影响

　　为了克服患者外周血细胞中白血病幼稚细胞比例随着化疗时间的延长发生变化对实验结果的影响，又鉴于白血病患者骨髓细胞以白血病幼稚细胞为主，故进一步研究了VP-16及干扰素在体外对TRAIL在急性白血病细胞表达的影响。首先观察了VP-16联合干扰素对TRAIL表达的时间效应，结果表明，TRAIL在骨髓单个核细胞的表达水平(MFI)随着药物作用时间的延长而增高，与药物处理前相比，作用24小时后TRAIL表达显著提高(P<0.05)(表2，图2)。然后在体外培养体系中分别研究了VP-16、干扰素以及VP-16联合干扰素的作用。在药物作用24小时后进行流式细胞术分析，与空白对照组相比，VP-16及干扰素均增加TRAIL在急性白血病患者骨髓单个核细胞的表达水平，但是干扰素对TRAIL表达水平的影响无统计学意义(P>0.05)，而VP16或者两药联合作用于急性白血病患者骨髓单个核细胞，均使TRAIL的表达水平有所提高(P<0.05)，且TRAIL在两药联合组的表达高于VP-16组，但两组间无显著性差异(P>0.05)。

　　讨 论

　　TRAIL及其受体在肿瘤监视中发挥重要作用。文献报道，应用人可溶性重组TRAIL处理28株人源肿瘤细胞株后发现，TRAIL对绝大多数人肿瘤细胞(19株)具有凋亡诱导作用，对其余9株需较高浓度才起作用，而对正常细胞不敏感[3]。Plasilova等[4]研究发现，TRAIL可诱导K562、HL-60、ML-1等白血病细胞的凋亡并呈剂量依赖性，在用TRAIL处理急性白血病患者骨髓细胞后显示，ANLL、CML和MDS患者髓系CFU-GM集落形成显著减少，细胞的生长显著受抑，而血液学完全缓解的ANLL患者、未累及骨髓的淋巴瘤患者及正常人骨髓前体细胞和正常脐血前体细胞对TRAIL的处理无反应，这些细胞的生长和增殖不受TRAIL的影响。Lee等[5]用TRAIL处理正常脐血单个核细胞与Jurkat细胞的混合液时，发现TRAIL可特异性清除Jurkat细胞，而正常CFU-GM集落数目没有减少。本研究在前两者的基础上直接检测了TRAIL在急性白血病细胞的表达，由于未化疗的急性白血病细胞TRAIL表达在蛋白水平上未能检测到，因此检测了化疗过程中TRAIL的表达。本研究结果显示，化疗早期可诱导TRAIL在白血病细胞的表达，化疗第3天达到高峰;然后随着化疗的延长，其表达又逐渐下降;通过CD45/SSC设门分析白血病幼稚细胞后发现，随着化疗药物的应用，患者外周血中白血病幼稚细胞所占的比例逐渐降低，这一因素可能影响了化疗第3天后TRAIL表达水平的分析。由此推断，化疗药物诱导TRAIL在急性白血病细胞的表达，这些TRAIL蛋白进而诱导相邻的急性白血病细胞或其自身发生凋亡。这种机制可能在化疗中起着一定的杀伤白血病细胞的作用。

　　早期的研究发现IFN-α可上调活化的T细胞表面TRAIL的表达[6];国内的研究也发现，ATRA或As2O3在处理NB4细胞系后，可诱导TRAIL基因的表达，TRAIL可能以类似“旁分泌”作用方式杀伤NB4细胞，诱导细胞凋亡[7]。VP-16是急性白血病化疗中常用的拓扑异构酶Ⅱ抑制剂，作为一种凋亡诱导剂，它可以诱导白血病细胞的凋亡，但是其累及的死亡分子尚不十分清楚。在用VP-16和IFN-α联合处理白血病细胞的过程中发现，两药联合处理可以提高TRAIL在白血病骨髓单个核细胞的表达，且与药物作用的时间有关，这与化疗药物在体内对白血病外周血单个核细胞表达TRAIL的影响相一致，提示这些化疗药物可能通过诱导TRAIL的表达杀伤白血病细胞，诱导细胞凋亡。

　　进一步的研究发现，VP-16及其联合干扰素处理使TRAIL在白血病骨髓单个核细胞的表达有所提高，但单独干扰素处理并未显著增加TRAIL的表达。这与文献报道的IFN-α可上调活化的T细胞表面TRAIL的表达不符，其原因可能是本研究中培养的骨髓单个核细胞主要为原代白血病细胞，而免疫活性细胞所占的比例很小，故单独用干扰素处理原代白血病细胞后虽然能够诱导TRAIL的表达，然而其表达水平较低。这一结果提示干扰素不能通过对TRAIL表达水平的影响而发挥抗急性白血病效应，这与单独应用IFN治疗急性白血病临床疗效差的结果一致。

　　我们在体内外研究TRAIL的表达结果提示：化疗药物如VP-16等诱导白血病细胞表达TRAIL，进而通过TRAIL介导白血病细胞凋亡。这种机制可能在化疗药物杀伤白血病细胞效应中起着一定的作用。

　　【参考文献】

　　1Gura T. How TRAIL kills cancer cells，but not normal cells. Science，1997; 277(5327):768-775

　　2赵湜，王红祥，毛红等. 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL及其受体在急性髓系白血病细胞中的表达及意义.中国实验血液学杂志，2005; 13: 65-69

　　3王梁华，朱玉平，蔡清萍等.TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡及其与FHIT基因突变关系的初步研究.第二军医大学学报，2002; 23: 136-139

　　4Plasilova M，Zivny J，Jelinek J，et al. TRAIL (Apo2L) suppresses growth of primary human leukemia and myelodysplasia progenitors. Leukemia，2002;16: 67-73

　　5Lee NS，Cheong HJ，Kim SJ，et al. Ex vivo purging of leukemia cells using tumor-necrosis-factor related apoptosis-inducing ligand in hematopoietic stem cell transplantation. Leukemia，2003; 17: 1375-1383

　　6Kayagaki N，Yamaquchi N，Nakayama M，et al. Type 1 in- terferons (IFNs) regulate tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) ex[x]pression on human T cells:a novel mechanism for the antitumor effects of type 1 IFNs. J Exp Med，1999; 189:1454-1460

　　7王玲玲，张茂宏.维甲酸、三氧化二砷诱导NB4细胞TRAIL基因表达的研究.临床血液学杂志，2003; 16:130-131