白血病患者的杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性研究

作者：陈阿梅　　作者单位：内蒙古医学院组织学与胚胎学教研室, 呼和浩特010059

　　【摘要】本研究检测白血病患者的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulinlike receptors, KIR)基因的多态性，探讨KIR 基因的多态性与白血病发生的关联性。应用PCRSSP技术对北方地区50例白血病患者和60名健康对照者进行KIR基因的检测和分析。结果表明：共检出目前已知的18个KIR基因，在检测的全部个体中，3DL3, 3DL2及2DL4出现频率均为，其余依次为3DP1、2DP1、2DL3、3DL1、2DL1、 3DS1、2DL5、 2DS4、2DS2、1D、2DS5、2DL2、 2DS1、2DS3 和3DP1v。与正常对照组比较，白血病患者的3DL和2DL1的基因频率(0.60)和(0.57)比对照组(1.00)显著降低(P<0.01)。结论： KIR基因的多态性与白血病的易感性有较为密切的关系。

　　【关键词】 白血病,KIR基因,基因多态性

　　Abstract The study was purposed to investigate the polymorphism of killer cell immunoglobulinlike receptor (KIR) gene of the patients with leukemia and to explore the correlation between the KIR gene and susceptibility of leukemia. The KIR genotype of 50 patients with leukemia and 60 healthy controls in northern. Hans were analyzed by PCRSSP. The results indicated that the present known 18 KIR genes were detected and identified. The frequencies of KIR 3DL3, 3DL2 and 2DL4 were in all subjects, with the most frequent genotype KIR 3DP1 (0.86) followed by 2DP1， 2DL3，3DL1，2DL1，3DS1，2DL5，2DS4，2DS2，1D，2DS5，2DL2，2DS1，2DS3 and 3DP1v in leukemia successively. Compared with the control, the KIR 3DL1(0.60)and 2DL1(0.57)were significantly lower in the leukemia patient group than that in the control group(1.00)(P<0.01). It is concluded that the polymorphism of KIR gene is associated with susceptibility of leukemia in Hans. There may be a negative correlation between pathogenesis of leukemia and KIR 3DL1, KIR 3DS1, KIR 2DL1, KIR 2DL5 genes .

　　Key words KIR gene; gene polymorphism; leukemia

　　NK细胞的功能由不同的受体调节，其中有一类重要的受体被称为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulinlike receptors, KIR)，它们通过识别HLA I类分子而保护正常的细胞免受自身NK细胞的攻击。KIR 分为抑制型和活化型两组受体，每一组均有其特定的细胞外结构域, 且均与特定的配体结合。KIR由于其穿膜、细胞内或细胞浆结构域的差异,并能与不同的MHC I 类亚型配体相结合,因而分别介导抑制性或活化性应答反应。编码KIR的一系列基因位于人类染色体19q13.42，具有极其丰富的多态性。KIR基因是继HLA系统后又一被发现的具高度多态性的基因，但与HLA基因不同的是 KIR基因数目在不同NK细胞克隆及不同个体有差异[1，2]。KIR基因是广泛参与免疫调节免疫反应的重要基因。我们采用PCRSSP检测技术对50例白血病患者进行KIR基因的检测和分析，以探讨KIR 基因的多态性与白血病发生的关联性。

　　材料和方法

　　研究对象

　　患者50例，男性30例，女性20例，平均年龄14.23岁，15岁以下有38例，15岁以上12例，小年龄3岁，大年龄为45岁。50例中急性淋巴细胞性白血病21例，慢性髓性白血病29例，全部为中国北方汉族。北方地区无血缘关系的随机健康汉族61名为正常对照，其中男性35例,女性26例，年龄20-60岁。

　　研究方法

　　DNA抽提 取5 ml枸橼酸钠抗凝血,使用美国Biosynthesis公司生产的BioFastTM DNA 提取试剂盒抽提DNA，操作按该试剂盒操作说明书进行。

　　PCR/SSP 参照张磊等[3]所用方法进行, 18对引物由上海第二医科大学免疫研究所范立安教授提供, Taq DNA聚合酶及dNTP购自上海申能博采生物科技有限公司。

　　阴阳性对照和内对照 本研究采用已知型别的标本作为阳性对照和阴性对照， 用2对2DL4基因特异型引物为内对照, 内对照引物的浓度为各特异型引物的1/5。

　　统计学处理

　　KIR基因出现频率(f)通过计数测得，KIR基因频率(gene frequency, p)计算公式为：p=1-N(1-f);基因型频率(genotype frequency)=n/N, n为基因型阳性数，N为研究个体人数。患者组与正常对照组间差异显著性用SPSS 11.0 统计软件四格表χ2检验公式计算。

　　结 果

　　KIR基因表型和基因频率

　　在所研究的50例白血病患者个体中共检出了目前已知的18个KIR基因。其中3DP1检测出了KIR 3DP1的纯合子及KIR 3DP1与KIR 3DP1v的杂合子，但未检测出KIR 3DP1v的纯合子。在检测的全部个体中3DL3，3DL2及2DL4出现频率均为。

　　50例白血病患者的KIR基因表型分布较常见的为KIR 3DP1，2DP1，2DL3、3DL1、3DS1，2DL5及2DS4，基因表型频率依次为98.00%，96.00%，88.00%，84.00%，60.00%，50.00%及48.00%, 其次为2DS2，1D，2DS5，2DL2和2DS1，表型频率2DS2为44.00%, 其余依次为40.00%, 36.00%，34.00%和30.00%，较低者为2DS3及3DP1V, 基因表型频率分别为18.00%及0(表1)。

　　白血病病例组和正常对照组比较，KIR 2DL1和3DL1基因型频率显著降低(P<0.01);病例组的3DS1和2DL5基因频率也低于正常对照组(P<0.05)，而其他KIR基因位点频率未发现统计学差异。

　　KIR基因频率与不同型白血病的相关性

　　KIR基因频率与ALL的相关性 在21例急性白血病患者中，高频率基因有KIR 3DP1，2DP1，2DL1，2DL3，3DL1，2DL5，2DS及3DS1, 基因表型频率依次为95.2%，95.2%，90.5%，85.7%，76.2%，57.1%，76.2%及66.7%。较低者为2DS3及3DP1v, 表型频率分别为14.3%和0。急性白血病组和正常对照组比较，3DL1基因型频率显著降低(P<0.01)。病例组的2DS4基因频率显著高于正常对照组(P<0.05)(表2)。

　　KIR基因频率与CML的相关性 在CML的研究中发现KIR 2DL1基因频率(0.509)比正常对照组(1.000)显著降低，KIR 2DL1与CML呈现强负相关P<0.001，与CML负相关的KIR基因尚有3DS1，2DL5和3DL1， P值分别等于0.021，0.029，0.031。其他KIR基因位点频率未发现统计学差异(表3)。

　　讨 论

　　目前白血病在我国是威胁儿童和青少年生命健康常见的恶性肿瘤之一，它的发生与多种因素有关，其中一些易感基因或免疫应答基因的表达增强和下调及NK细胞的功能异常在白血病的发生和发展中起到了很重要的作用[4，5]。NK细胞的功能取决于其膜上的抑制型受体( KIR 3DL1，KIR 3DL2，KIR 2DL13，KIR 2DL5)和激活型受体(KIR 2DS15, KIR 3DS1)之间的平衡。抑制性受体识别并结合相应的HLAI类配体，通过胞质内免疫酪氨酸抑制基序传导抑制性信号，从而保护自身细胞免受NK细胞的攻击。激活性受体与其相应配体结合,通过跨膜区带电荷的氨基酸残基与结合蛋白DPA12偶联，通过DPA12 分子中的ITAM基序产生活化信号，使多种激酶磷酸化，进而激活一系列活化通路中的蛋白，终使NK细胞发挥杀伤功能。HLA表达于人体几乎所有有核细胞表面,并与免疫细胞表达的免疫球蛋白、T细胞受体分子共同参与免疫识别和免疫应答,这是机体抵御异己的防线。因此，KIR基因的多态性决定着机体对病毒等生物致病因素的免疫能力，也就是说KIR在白血病的发生和发展中起着重要的作用。编码KIR的一系列基因位于人类染色体19q13.42。目前已知的KIR基因共18个，其中含有 2个Ig样结构域的为KIR 2D ,包括KIR 2DL15、KIR 2DS15;含有 3个Ig样结构域的为KIR 3DL13、KIR 3DS1;另外还有KID 1D(KIR 2DS4的等位基因 ),编码产物为只含D1结构域的可溶性蛋白。除编码基因外,还有 2个假基因KIR 3DP1和KIR 2DP1。

　　我们用PCR/SSP技术分析了北方汉族人群KIR基因与白血病患者的关联，发现病例组中KIR 3DL1、3DS1、KIR 2DL1、 2DL5基因的频率显著降低，这与龚卫娟等[6]在血清阴性脊柱关节病研究中KIR 3DL1基因频率显著降低的结果较为一致。这进一步提示KIR 3DL1对正常人不论是南方人还是北方人都可能是一种保护性基因。Martin等[8]在艾滋病的研究中发现，KIR 3DS1 和HLAB alleles编码的分子的结合可推迟HIV感染者的发病进程[8]。我们的研究结果也显示患者组3DS1基因的频率显著降低以及KIR 2DL1和2DL5抑制性受体基因的减少。这一结果证实了NK细胞活性下调引起发病这一事实，也提示这些基因频率的降低可能与NK细胞的活性降低有关。

　　本研究分析KIR基因与急性淋巴细胞性白血病的相关性，发现3DL1和2DS4基因频率均与ALL相关，此结果对区分白血病临床分型、早期预测ALL发展趋势具有一定的参考意义。

　　在慢性粒细胞白血病的研究中发现2DL1与CML呈明显的负相关，另外KIR基因有3DS1、2DL5和3DL1与慢性粒细胞白血病的易感性有关。 本研究结果显示,多个KIR基因与白血病相关联,且不同类型的白血病相关的KIR基因也不完全相同,这表明了KIR与白血病发病的相关性及复杂性，但由于样本量小，要揭示KIR基因在白血病发病中的作用有待进一步的研究。

　　致谢:上海第二医科大学免疫研究所范立安教授提供引物及技术指导，在此致以谢意。

　　【参考文献】

　　1Vilches C, Pando MJ, Parham P. Genes encoding human killercell Iglike receptors with D1 and D2 extracellular domains all contain untranslated pseudoexons a third Iglike domain. Immunogenetics, 2000;51:639-646

　　2Selvakumar A, Steffens U,Dupont B. NK cell receptor gene of the KIR family with two IG domains but highest homology to KIR receptors with three IG domains.Tissue Antigens, 1996; 48(4 Pt 1):285-294

　　3张磊， Katharine C.Hsh, LIU XiaoRong等.人类KIR基因PCRSSP分型及家系研究.上海免疫学杂志，2003; 23：99-103

　　4Valiante NM, Lienert K, Shilling HG, et al. Killer cell receptors:keeping pace with MHC class I evolution. Immnol Rev, 1997;155:155-164

　　5李丹,郗斌,刘海燕等. HLAI类基因与白血病相关性研究. 中国实验血液学杂志，2005; 13: 563 - 566

　　6龚卫娟，杨钰琴，张磊等.杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性与血清阴性脊柱关节病的关联性研究. 中华风湿病学，2003，7：456-468

　　7Martin MP, Gao X, Lee JH, et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLAB delays the progression to AIDS. Nat Genet, 2002; 31:429-434

　　8Martin MP, Nelson G, Lee JH, et al. Cutting edge: susceptibility to psoriatic arthritis: influence of activating killer Iglike receptor genes in the absence of specific HLA C alleles. J Immunol， 2002; 169:2818-2822′′ ′′