增殖抑制基因在结直肠癌中的表达及其意义

　作者：艾建中,姜广建,李玉红　　作者单位：1.河北唐山市工人医院肿瘤外科;2.华北煤炭医学院生命科学系

　　【摘要】 目的 探讨增殖抑制基因(HSG)在结直肠癌中的表达及其意义。方法 应用免疫组化法检测HSG在结直肠正常粘膜、良性病变及恶性肿瘤组织中HSG的不同表达变化。结果 正常粘膜、良性腺瘤、结直肠癌组HSG的阳性表达率分别为94.2%、74.2%和50.9%，与正常粘膜组和良性腺瘤组比较，结直肠癌组HSG表达率下降，差异有统计学意义(P<0.05);HSG蛋白表达与肿瘤分化程度无相关性(P>0.05)，而与肿瘤淋巴结转移和临床病理分期密切相关(P<0.05)。结论 结直肠癌组织中HSG蛋白表达显著低于良性腺瘤和正常粘膜组织，提示HSG蛋白在结直肠癌演变中具有重要意义。

　　【关键词】 HSG;结直肠癌;良性腺瘤;正常粘膜

　　增殖抑制基因 (hyperplasic suppress gene,HSG) 是陈光慧等[1,2]利用 mRNA差异显示技术从正常血压和高血压大鼠的血管平滑肌细胞中发现的新基因。前期的研究表明，高血压动物模型中HSG在增生活跃的血管平滑肌中呈低水平表达，而且转染外源性HSG可明显地抑制血管平滑肌细胞的生长，转染外源性HSG对多种肿瘤传代细胞系同样也具有明显的生长抑制和诱导凋亡的作用[3]。本文旨在观察HSG在不同结直肠组织中的表达变化，初步探讨HSG对结直肠癌演变的影响。

　　1 资料和方法

　　1.1 临床资料

　　收集唐山市工人医院 2003 年 12 月～2005 年 12 月手术切除的直肠癌标本 53 例，高分化癌 20 例，中分化癌 20 例，低分化癌 13例;其中男24 例，女29 例，年龄41 ～75 岁，平均年龄 56 岁;Ⅰ+Ⅱ期 20 例，Ⅲ+Ⅳ期 33 例。淋巴结转移阳性31例，淋巴结转移阴性22例。所有患者术前均未进行放疗、化疗或激素治疗。以良性腺瘤标本31例和正常人粘膜组织37例做对照。

　　1.2 主要试剂

　　兔抗人 HRG1 多克隆抗体由北京大学陈光慧教授馈赠;免疫组织化学染色试剂盒购自美国Santa Cruz 公司。

　　1.3 实验方法

　　石蜡切片组织55℃烤4h后，常规脱蜡至水，3% H2O2 去除内源性过氧化物酶，蛋白酶K 37℃ 消化10min，兔血清封闭非特异性抗原，加入HSG抗体，室温过夜，生物素标记二抗，酶标三抗，室温孵育各20min，DAB 显色，苏木精复染核，脱水，透明和封片。

　　1.4 结果判定

　　HSG以细胞浆、细胞膜或细胞核出现棕黄色颗粒，且其着色强度显著高于背景者判定为阳性。

　　HSG计量方法：蛋白表达的判定以染色强度和阳性细胞百分率的得分之和进行评定。(a)染色强度：阴性为 0，弱阳性为 1，阳性为 2，强阳性为 3;(b)阳性细胞百分率：无阳性细胞为 0，<25% 为1，26%～50%为2，>50%为3，a+b之和高为6，0～2判为阴性，3～6判为阳性。

　　应用Image Pro plus数码分析系统进行图像分析，在光学显微镜下随机选取5个视野，测定细胞的平均光密度值和累计光密度值，计算测得值的平均值作为终值。

　　1.5 统计学分析

　　所有数据以±s表示，SPSS11.0软件处理。样本均数的比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义，计数资料采用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 HSG在结直肠不同组织中的表达

　　HSG 阳性染色主要集中于细胞核周围，呈棕黄色颗粒，细胞浆有少量表达。在结直肠癌中，HSG蛋白表达的平均光密度值和累积光密度值明显低于正常粘膜和良性腺瘤对照组(P<0.05)，而正常粘膜和良性腺瘤组的HSG值差异无统计学意义(P>0.05)，HSG在结直肠不同组织中的光密度值 *P<0.01，同良性腺瘤组比较;△P<0.01，同正常粘膜组比较 与正常粘膜和良性腺瘤组比较，结直肠癌组 HSG 表达率呈下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，HSG在结直肠不同组织中的表达 * χ2=4.389 P<0.05 ,同良性腺瘤组比较;△χ2=16.729 P<0.01,同正常粘膜组比较

　　2.2 HSG与结直肠癌临床病理参数之间的关系

　　HSG在高、中、低分化癌组织中的表达分别为45.5% (9/20)、55.0% (11/20)、53.8%(7/13)，χ2=0.458,P=0.795，差异无统计学意义;HSG在淋巴结转移阳性组表达率38.7% (12/31) 显著低于淋巴结转移阴性组68.2% (15/22)，χ2=4.474，P=0.034;直肠癌Ⅲ+Ⅳ期中HSG阳性表达率为33.3% (11/33)，显著低于Ⅰ+Ⅱ期中的80.0%(16/20)，χ2=4.74，P=0.029。

　　3 讨论

　　增殖抑制基因(HSG)是陈光慧等利用mRNA差异显示技术对SHR和WKY大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)cDNA文库进行筛选时分离得到的一个与VSMC增殖相关的新基因，因其在SHR和VSMC中表达活性降低而得名。基因全长4.16kb，可编码661个氨基酸，后来发现，该基因不仅在血管平滑肌内皮细胞中表达，在心、肾、脑、肺、肝、白细胞等不同组织中也有广泛分布。有研究揭示，转染hrg1蛋白能抑制Raf (Raf1)和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性，下调抗细胞凋亡基因(bcl2)和增殖细胞核抗原(PCNA)基因表达及抑制细胞增殖[4]。姜广建[5]等发现HSG通过上调p27和下调cyclinE表达而发挥抑制VSMC增殖的作用。Santel等[6]发现，该基因可以控制线粒体的形态学变化，因而也与一些人类疾病相关，并在细胞信息的传导中起着重要的作用。HSG定位于人的1p36.3位置，此区域为许多肿瘤的突变高发区，许多肿瘤患者染色体的这一区带会出现缺失或易位。王萍[7]等研究发现HSG对多种肿瘤传代细胞系具有明显的增殖抑制作用，与放线菌酮(CHX)并用可增强肿瘤细胞对 CHX的敏感性，具有协同作用，提示HSG有可能是新的抑癌基因。

　　目前，国内外尚无对HSG在肿瘤发生发展中表达变化的相关研究报道。本研究利用免疫组化法检测结直肠癌、良性腺瘤和正常粘膜组织中的HSG表达，以期探讨HSG是否具有抑制结直肠癌的恶性细胞增殖作用。结果表明：在结直肠癌组中，HSG蛋白的表达低于良性腺瘤组及正常粘膜组，而良性腺瘤与正常粘膜组表达无差异，提示HSG的表达可能在抑制细胞恶性增殖中及结直肠癌的发生发展中起一定作用。这与李志新[8]观察的外源性转染大鼠HSG(rHSG)对肿瘤细胞具有明显且广泛的生长抑制作用结果相似。

　　HSG表达与肿瘤分化程度无关，而与肿瘤淋巴结转移和临床病理分期密切相关，提示HSG有望作为判定肿瘤分化程度、病理分期的一种新的参考指标。

　　【参考文献】

　　[1] 陈光慧,张晨辉,朱燕清,等.一个新的高血压相关基因的克隆和表达[J].中华医学杂志,1997,77(12)：823827.

　　[2] 陈光慧,高炜,汤健,等.同型半光氨酸诱导的新的cDNAs[J].中国生物化学与分子生物学学报,1998,14(33)：811.

　　[3] Chen KH,Tang J,Ma DL,et al.Cloning and ex[x]pression of a novel cDNA related to Hypertension[J].Chin Med J,1998,111(5)：384386.

　　[4] Chen KH,Guo X,Ma D,et al.Dys regulation of HSG triggers vascular proliferative disorders[J].Nat Cell Biol,2004,6(11)：872883.

　　[5] 姜广建,温进坤,韩梅.高血压相关基因hrg1对血管平滑肌细胞 周期蛋白E和p27蛋白表达及细胞增殖的影响[J].中国老年学杂志,2004,10(24)：923926.

　　[6] Santel A,Fuller MT.Control of mitochondrial morphology by a human mitofusin[J].J Cell Sci,2001,114 (5)：867874.

　　[7] 王萍,毋丽娜，蒋春笋，等.人增殖抑制基因(HSG)对肿瘤细胞系化疗敏感性的作用.北京大学学报(医学版)，2005，2(37)：117120.

　　[8] 李志新.癌增殖相关蛋白1(CPRP1)重组腺病毒对不同 肿瘤细胞系抑制效应的体内外研究[D].北京：北京大学在职人员申请硕士学位论文，2003，3855.