莪术油对人乳腺癌MCF7细胞凋亡及Bcl2、Bax表达的影响

     作者：杨丽华 姜 杰 作者单位：厦门大学医学院 厦门 361005 福建省厦门市卫生局

　　【摘要】 目的：观察中药提取物莪术油(zedoray turmeric oil)对人乳腺癌(human breast cancer)细胞系MCF7的凋亡诱导作用。方法：用不同浓度的莪术油对体外培养的MCF7细胞进行干预。分别采用MTT、细胞免疫组织化学染色、流式细胞仪检测等方法，观察其对MCF7细胞增殖的抑制和凋亡诱导作用，并对凋亡相关Bcl2与Bax蛋白的表达变化进行定性检测。结果：经不同浓度的莪术油处理后的MCF7细胞，其生长受到明显的抑制，细胞凋亡指数随药物浓度增加而明显增加;莪术油作用后，细胞中Bax蛋白表达明显高于对照组。结论：一定浓度的莪术油能抑制MCF7细胞增殖，促进其凋亡;其机制可能与调控Bcl2、Bax 表达有关。

　　【关键词】 乳腺癌 莪术油 MCF7细胞 Bcl2 Bax

　　Abstract ob[x]jective:To investigate the effects of Zedoray Turmeric Oil on inducing apoptosis of MCF7 cells and to explore the possible mechanism of its action.Methods:Different concentrations of Zedoray Turmeric Oil were used in the culture system of MCF7 cells.Proliferation and apoptosis of MCF7 cells were observed by ways of MTT,immunocytochemistry,and flow cytometry quantitative analysis.The ex[x]pression of Bcl2 and Bax protein was determined by qualitative analysis.Results:Proliferation of MCF7 cells was inhibited effectively after being treated by different concentrations of Zedoray Turmeric Oil.The rate of apoptosis increased as the increase in the concentration of Zedoray Turmeric Oil.The ex[x]pression of Bcl2 was decreased in the experimental groups,whilethe ex[x]pression of Bax protein was significantly higher than that the control group.Conclusion:Zedoray Turmeric Oil can effectively inhibit proliferation of and promote apoptosis of MCF7 cells; the mechanism may be correlated to the up regulation of Bax and down regulation of Bcl2.

　　Key words breast cancer Zedoray Turmeric Oil MCF7 Bcl2 Bax

　　莪术是我国传统中药之一， 是姜科草本植物莪术、 郁金的根茎， 味辛、 苦， 性温， 归肝、 脾经， 具有行气破血、 消积止痛的功效。 莪术油(zedoary turmeric oil)是莪术中提取的挥发油， 含有多种抗肿瘤有效成分。 对多种实体肿瘤(如子宫内膜癌、 宫颈癌、 白血病、 肺癌、 肝癌、 结肠癌、 乳腺癌等)有较强的抑制作用[1]， 而且具有抗血栓、 抗病毒、 抗菌和增强免疫等功能[24]。 张瑾峰等[5]发现， 莪术与三棱联合应用具有诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。 本研究通过一定浓度的莪术油作用乳腺癌细胞系MCF7后， 观察其对MCF7细胞的凋亡诱导效应， 并通过对与凋亡相关的Bcl2和Bax蛋白表达变化的检测， 探讨莪术油对MCF7细胞凋亡诱导的作用机制。

　　材料与方法

　　1.1 材料及仪器

　　人乳腺癌MCF7细胞株(厦门大学生命科学学院提供)。莪术油注射液(徐州莱恩药业有限公司，国药准字：H20067076)，配制为20g/L的无菌溶液备用。RPMI 1640、二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(北京中杉金桥生物技术有限公司)。鼠抗人Bcl2、Bax单克隆抗体及SP免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。流式细胞仪(美国GENE公司)。实验时选用对数生长期细胞。

　　1.2 MTT法生长曲线测定

　　取对数生长期的MCF7细胞，消化后制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×104 个/ml， 接种于96孔培养板上，每孔加200μl细胞悬液，培养24小时后，加入不同浓度的莪术油(0.15、0.25、0.35、0.50、1.0mg/ml)，另设对照组(不加莪术油)和空白对照组(只加培养基)，每组设 7个复孔，分别于加药后1、2、3、4、5、6、7、8和9天时加MTT(5mg/ml)20μl，孵育4小时后，加入二甲基亚砜200μl，避光振荡10min，酶标仪在570nm处测定各孔吸光度(OD)值，取平均值，以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

　　1.3 流式细胞仪检测凋亡

　　不同浓度的莪术油(0.15、0.25、0.35、0.50、1.0mg/ml)分别作用于贴壁生长的MCF7细胞72小时后，胰酶消化，吹打脱落，使细胞分散良好，1500r/min离心5min，弃上清，加 1×缓冲液200μl。各管中分别加入AnexinV 4μl和PI 5μl，用1×缓冲液将终体积配成250μl， 冰浴，上机检查。以不加莪术油培养72小时的MCF7细胞作为阴性对照。

　　1.4 免疫细胞化学染色

　　将对数生长期的MCF7细胞6瓶(细胞数>1×105/瓶)随机分为对照组和实验组， 每组3瓶。实验组用含0.35mg/ml莪术油的培养基培养，对照组正常培养，48小时后终止培养。随机从对照组和实验组各取1瓶细胞，用0.2%胰酶消化后收集细胞，做细胞涂片。4℃丙酮固定20min，1XPBS洗3次，每次5min。自然干燥后，按PV9000试剂盒要求，行Bcl2和Bax免疫细胞化学染色，并分别设立阴性与阳性对照。结果判定：Bcl2和Bax阳性细胞为胞质染为黄色或棕黄色，阴性细胞均不着色。通过染色强弱，观察两种蛋白表达改变的趋势。

　　1.5 统计学方法

　　应用SPSS18.0统计软件，计量资料用(±s)表示，t检验，P<0.05为显著性检验水准。

　　2 结 果

　　2.1 莪术油对MCF

　　7细胞形态变化的影响 实验组细胞在加药后24小时，倒置显微镜下观察，可见大部分细胞由梭形变为不规则形，胞体增大，胞内可见大小不等的空泡样结构，细胞核边移，但大部分细胞膜尚完整，尤以1.0mg/ml组细胞形态变化明显，并且细胞数量与对照组比较明显减少，同时有许多细胞漂浮，不贴壁。

　　2.2 莪术油对MCF

　　7细胞生长的影响 根据酶标仪所测的不同时间及不同浓度莪术油作用后的 OD值绘制MCF7细胞生长曲线。从该生长曲线可见，MCF7细胞经5种不同浓度的莪术油处理后，细胞生长受到不同程度的抑制，以1.0mg/ml组的抑制作用强，见图1。图1 MCF7细胞生长曲线2.3 对细胞凋亡率的影响 不同浓度(0.15、0.25、0.35、0.50、1.0mg/ml)的莪术油作用于MCF7细胞72小时后，上机检测，流式细胞仪作出细胞DNA含量分布图，计算机软件自动拟合出凋亡指数(%)。对照组凋亡指数为4.53%， 实验组分别为10.17%、17.10%、23.15%、26.43%和30.12%。随药物浓度增加，细胞凋亡指数呈上升趋势。

　　2.4 细胞免疫组织化学染色结果

　　Bcl2染色显示，对照组细胞浆浓染呈棕黄色，实验组细胞浆着色明显减弱，呈淡黄色，个别细胞甚至呈阴性。Bax染色显示，对照组细胞浆染色呈淡黄色，实验组细胞浆着色则明显增强，尤以核周明显，黄染加重。

　　3 讨 论

　　文献报道[1]，一定浓度的莪术油在体外可诱导人子宫内膜癌RL952细胞，肝癌SMMC7721细胞、胃癌NKM45细胞、肺癌SPCA4细胞和肝癌细胞HepG2细胞凋亡，且其诱导凋亡的作用随莪术油的浓度增加而增加。蒲磊等[6]研究表明，莪术油可抑制乳腺癌MCF7细胞增殖，促进细胞凋亡，其机制可能与上调Fas蛋白、下调FasL蛋白表达有关。

　　本研究用0.15～1.0mg/L的莪术油作用乳腺癌细胞株(MCF7)1～8天后，细胞生长受到不同程度的抑制。从MTT的实验结果看，0.15mg/ml浓度的莪术油对MCF7细胞的增殖抑制作用不明显，而0.35mg/ml及更高浓度的莪术油则可使细胞增殖受到明显抑制，且随着作用浓度的增高和作用时间的延长，细胞增殖受抑制更为明显，提示莪术油对MCF7细胞的增殖有抑制作用，而且呈时间和浓度依赖性。用不同浓度的莪术油分别作用 MCF7细胞72小时后，细胞凋亡率检测发现，在药物浓度为0.35mg/L，即有明显的细胞凋亡发生，随药物浓度的增加，细胞凋亡率呈上升趋势;并且在药物浓度为0.35mg/L时， 凋亡率已达23.15%。由此提示，莪术油在体外具有抑制MCF7细胞生长增殖、诱导凋亡的作用，且这一作用随药物作用的浓度增加而增加。根据生长曲线计算，莪术油对MCF7细胞的半数有效量在0.325mg/L左右。研究结果显示，莪术油能下调MCF7细胞的Bcl2表达，同时上调Bax的表达，两种蛋白比例发生明显变化。结合细胞凋亡率检测结果推测，莪术油诱导MCF7细胞凋亡可能与其改变凋亡相关蛋白Bcl2/Bax的表达有关。

　　以上结果提示,莪术油在体外对MCF7的生长增殖有明显抑制作用，同时诱导该细胞凋亡，有可能是一种有希望的抗肿瘤中药。其作用机制可能与莪术油调控MCF7细胞的凋亡相关基因Bcl2/Bax的表达有关，而不是单纯的细胞毒性坏死。