罗格列酮抑制NE和PMA诱发心肌肥大的研究

　作者：朱肖星,牛小麟,马晓涛,魏瑾,高登峰　　作者单位：西安交通大学第二附属医院心内科，陕西 西安 710004， 西安卫星测控中心，陕西 西安 710043， 解放军总医院第二附属医院心内科，北京 100091

　　【摘要】 目的： 研究罗格列酮(RSG)抑制去甲肾上腺素(NE)诱导的心肌肥大与蛋白激酶C(PKC)，cfos之间的关系. 方法： 在培养新生大鼠心肌细胞中，采用RSG，PKC的激动剂佛波醇酯(PMA)，NE和PKC的阻断剂白屈菜季氨碱(che)观察罗格列酮在NE和PMA诱导心肌肥大中对PKC活性和cfos的影响. 结果： PMA和NE均可促进心肌细胞蛋白质的合成和3H亮氨酸的掺入,并可增强心肌细胞PKC 活性，同时使PKC从胞质移位到细胞膜,RSG和che均有抑制蛋白质合成和3H亮氨酸掺入的作用,还有抑制心肌细胞PKC 活性的作用，RSG和che还可抑制NE增加cfos蛋白的表达. 结论： RSG抑制NE引起心肌肥大与PKC和cfos有关.

　　【关键词】 去甲肾上腺素;罗格列酮;蛋白激酶C;佛波醇酯类;心肌/细胞学
　　Inhibition of rosiglitazone on NE and PMA induced growthpromoting effects in rat cardiac myocytes in vitro　ZHU XiaoXing, NIU XiaoLin, MA XiaoTao， WEI Jin， GAO DengFeng, HAO GuangHua， TANG FaKuan　Department of Cardiology，Second Affiliated Hospital, Xian Jiaotong University， Xian 710004，China， Xian Satellite Control Center,Xian 710043,China， Department of Cardiology，Second Affiliated Hospital，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100091，China

　　【Abstract】 AIM: To investigate the inhibitory effects of rosiglitazone(RSG) on noradrenalin(NE)induced cardiac myocyte hypertrophy and the mechanism involved. METHODS: NE has been shown to be a potent stimulator for neonatal rat ventricular myocyte hypertrophy in vitro. We used the activator of PPAR γ(RSG), the inhibitor of protein kinase C(PKC) chelerythrine (che) to influence protein content.3Hleucine incorporation and activity of PKC were measured on cardiac myocytes stimulated by Chronic NE or PMA(the activator of PKC). RESULTS: After 2d culture, RSG not only inhibited the inducing effects of NE and PMA on the elevation of protein content and 3Hleucine incorporation on cardiac myocytes, but also decreased the enhancing effects of NE and PMA on the activity of PKC in myocytes. RSG and che decreased the enhancing effects of NE on cfos protein ex[x]pression. CONCLUSION: Inhibitory effects of RSG on NE inducing growthpromoting in myocytes are associated with PKC and cfos pathway.

　　【Keywords】 norepinephrine; rosiglitazone; protein kinase C; phorbol esters; myocardium/cytology

　　0 引言

　　罗格列酮(rosiglitazone，RSG)是过氧化物增殖物激活受体γ(PPARγ)的激动剂,在以往的研究中，报道RSG有降血压和抗心肌肥大的作用，但均有待进一步肯定，考虑影响整体动物实验的因素较多，在培养新生大鼠心肌细胞中，NE可诱导心肌肥大和促进蛋白质的合成,它是致心肌肥大的因子[1]. 研究RSG对NE和PKC的激动剂佛波醇酯(PMA)诱导心肌肥大的影响和机制，以阐明RSG在抗心肌肥大中作用. PKC广泛参与细胞信号转导、分泌、离子通道调节、细胞增殖、分化和癌变等一系列与生命相关的过程，是生物和医学界研究的一个热点. PKC抑制剂可以阻止α1受体激动剂所致心肌肥大，推测PKC可能是引起心肌肥厚的重要转导因子. 那么RSG抑制由NE，PMA诱导的心肌肥大与PKC和cfos有何关系? PKC是否是NE，PMA和RSG在心肌细胞内信号转导的共同通路，我们应用PKC的阻断剂白屈菜季氨碱(chelerythrine，che)，RSG，PMA和NE等来观察对心肌肥大和蛋白质合成的影响，同时采用测定PKC活性,寻找与PKC关系的证据，并探讨其相关机制.

　　1 材料和方法
　　1.1 材料 1～3 d龄新生SD品系大鼠乳鼠由第四军医大学实验动物中心提供. 新生牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司生产;考马斯亮蓝G250由华美生物工程公司提供;高糖DMEM培养基、5′溴脱氧尿苷(Brdu)和ITS是GIBCO产品;che，PMA，NE，胶原酶1均为Sigma公司的产品, RSG是Alexis公司的产品，PKC试剂盒为Upstate公司的产品，Western Blot试剂盒为博士德公司的产品.

　　1.2 方法

　　1.2.1 新生大鼠心肌细胞的分离与培养 按参考文献[2-3],在无菌条件下取出乳鼠的心脏，剪碎，用胶原酶1(1 g/L)消化成单细胞悬液，离心(1000 r/min, 5 min)弃上清，加入含100 mL/L新生牛血清，0.1 mmol/L Brdu的高糖DMEM重新悬浮，孵育90 min，收集未贴壁细胞(95%以上为心肌细胞)用于实验.

　　1.2.2 总蛋白含量测定 将心肌细胞接种于24孔培养板([5×105细胞/(mL•孔)]，培养48 h,换含10 g/L ITS的无血清高糖DMEM培养液，24 h 后每8孔为1组，完全随机分为对照组，NE (均为10-6mol/L)组，PMA(均为10-7mol/L)组，NE+ RSG组(其中RSG按浓度分为10-9mol/L，10-8mol/L 和10-7mol/L 3组)，NE+10-5mol/L che组，PMA+RSG组(其中RSG又按浓度分为10-9mol/L，10-8mol/L和10-7mol/L 3组),培养48 h,吸弃培养液，用生理盐水洗两次，每孔加入0.3 mol/L的NaOH溶液1 mL,加热(100℃)10 min,每孔吸出200 μL细胞裂解液，与1.8 mL考马斯亮蓝染液混匀，放置10 min,以可见光分度计(Beckman DU800)在595 nm测定溶液的光吸收值，以溶剂为空白对照，牛血清白蛋白(BSA7.8～500 mg/L)为标准品作标准曲线，测定各孔总蛋白含量(以mg/L表示).

　　1.2.3 测定心肌细胞的3H亮氨酸掺入 将细胞浓度[2.5×105细胞/(mL•孔)]的心肌细胞接种于24孔培养板上,每4孔为1组，72 h换入含3.7 KBq3H亮氨酸50 μL和各种药物,继续培养48 h. 将细胞收集于玻璃纤维滤膜上. 100 mL/L三氯醋酸破碎细胞并固定，用蒸馏水反复冲洗，以除去游离的同位素标记物. 滤膜烘干后置于含5 mL闪烁液的固定瓶内，用LS3801液体闪烁仪(Beckman)测定放射性强度.

　　1.2.4 测定心肌细胞PKC的活性 按参考文献[4]和PKC检测试剂盒说明进行. 裂解细胞、分离提取胞质与胞膜内蛋白质 ,紫外分光光度法测定蛋白浓度. 以上操作均在冰上而进行. 吸取含有相同质量蛋白质的胞质与胞膜提取液，加入[r32P]ATP和底物，37℃温浴5 min,点膜，37℃烘干，液体闪烁仪记数测定放射性强度，根据公式计算细胞膜和细胞质的PKC活性.

　　1.2.5 Western Blot测定Cfos蛋白的表达 分离、接种和培养心肌细胞，将培养板中的细胞分为： 正常对照组、NE处理组、NE+che组、NE+RSG组各组细胞均培养12 h. 收集所有细胞，参照文献[57]裂解细胞，BCA试剂盒蛋白定量后，SDSPAGE系统电泳转膜后加入一抗，包括cfos抗体(1∶400)，βactin抗体(1∶2000),二抗为HRP标记羊抗兔抗体(1∶1000)，重复3次.

　　统计学处理： 实验数据以x±s表示，多组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，均数间的多重比较用SNKq检验,，用Origin软件进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义.

　　2 结果

　　2.1 RSG和che抑制NE诱导心肌细胞蛋白含量和3H亮氨酸掺入率的增加 RSG从10-9mol/L到10-7mol/L浓度范围内均有降低NE刺激心肌细胞蛋白含量和3H亮氨酸掺入率增加的作用,其中10-8mol/L和10-7 mol/L的RSG及che降低NE效应有统计学意义(P<0.05，表1).

　　表1 RSG和che抑制NE诱导心肌细胞蛋白含量和3H亮氨酸掺入的增加(略)

　　aP<0.05 vs 对照; bP<0.01, cP<0.05 vs NE. RSG： 罗格列酮.

　　2.2 RSG抑制PMA诱导心肌细胞蛋白含量和3H亮氨酸掺入率的增加 RSG从10-9mol/L到10-7mol/L降低PMA刺激心肌细胞蛋白含量和3H亮氨酸掺入率的增加作用,其中10-8mol/L和10-7mol/L的RSG降低PMA效应有统计学意义(P<0.05，表2).

　　表2 RSG抑制PMA诱导心肌细胞蛋白含量和3H亮氨酸掺入的增加(略)

　　aP<0.05 vs 对照;bP<0.01, cP<0.05 vs PMA;RSG：罗格列酮.

　　2.3 RSG和NE对心肌细胞胞质、胞膜PKC活性的影响 在培养基中加入10-6mol/L NE,10 min可激活心肌细胞PKC,并促使PKC从胞质移位到细胞膜;PKC的激动剂PMA在10-7mol/L时,可激活PKC,并促进其向膜转移,PKC的选择性抑制剂10-5mol/L che和RSG(PPAR γ的激动剂)从10-9mol/L到10-7mol/L均可抑制NE和PMA激动PKC的作用.

　　2.4 RSG对NE诱导的cfos蛋白表达的影响 NE组平均辉度值分别为对照组的5.6倍(P<0.05)，NE+che组,NE+ RSG(10-7mol/L)组分别较NE组降低41%和36%(P<0.05,图1).

　　aP<0.05 vs 对照(C); cP<0.05 vs NE.

　　图1 RSG对NE诱导的cfos蛋白表达的影响(n=3)(略)

　　3 讨论

　　NE是一种收缩血管的儿茶酚胺，由交感神经末梢分泌，它是调节心血管活动的活性物质之一. NE可促进心肌细胞肥大，表现为蛋白质合成和3H亮氨酸掺入率的增加. NE刺激心肌肥大主要是通过α1受体，但β受体激活也有作用. α受体激活后使细胞内Ca2+通道开放，启动Ca2+跨膜内流和肌浆网Ca2+库释放Ca2+，胞内Ca2+浓度升高，激活PKC，进而激活细胞外信号调节的蛋白激酶(ERK),激活的ERK能转入核内,引起 cfos和cmyc等转录因子的磷酸化调节基因表达,促进蛋白质合成和心肌细胞的肥大[5-7]. cfos和cmyc是细胞生长分化的核内原癌基因，可以作为心肌肥大的初始指标之一，它们可促进RNA、蛋白质的合成，其中cfos的表达产物Fos是心肌重构中起重要作用，Fos是肥大基因表达和蛋白质合成的重要调节因子[1].

　　原发性高血压患者的并发症有心肌肥大，PPAR γ的激动剂RSG有降低血压的作用，在整体动物实验中，RSG可以减轻高血压大鼠的心肌肥厚程度[8-11]. 考虑整体动物实验的影响因素较多，不利于药物机制的分析，我们在细胞水平证明PKC的阻断剂白屈菜季氨碱可抑制NE与内皮素等引起心肌细胞蛋白质合成和3H亮氨酸掺入率的增加. 用PKC的激动剂佛波醇酯可明显增加心肌细胞的蛋白质含量和3H亮氨酸掺入率，在10-8～10-6mol/L佛波醇酯有剂量依赖性促进心肌细胞肥大的作用，表明PKC参与心肌肥大，PMA的结构类似DAG，在较低的浓度可以激活PKC，RSG可以抑制NE和PMA诱导的心肌肥大,表明罗格列酮可以通过PKC途径减弱NE诱导心肌细胞的肥大. 这种药物干预是间接证明，为了明确PKC是否参与，我们又测定了PKC的活性. NE和PMA使PKC活性增强，而RSG和che可使PKC活性降低. PKC是心肌细胞磷脂酰肌醇信号转导系统的重要组成部分，通常以钝化形式存在于心肌细胞胞质中,静息细胞内的DAG浓度不足以激活PKC.当心肌细胞受外界信号刺激后，磷脂酶C水解膜磷脂中的二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)生成二酰甘油(DAG)，使细胞内DAG浓度升高，促使PKC从胞质移位到细胞膜而激活PKC[12-15]. PKC通过磷酸化众多位于膜上和胞质内的底物蛋白而发挥作用，如细胞生长、免疫、运动、分泌和细胞间信息传递等. 本研究发现由NE和PMA引起PKC活性的增强，而RSG和PKC的阻断剂che均可逆转此作用. 进一步证明了罗格列酮可以通过PKC途径减弱NE诱导心肌细胞的肥大. 有报道α受体阻断剂哌唑嗪可完全阻断NE诱导的cfos和cmyc表达增强的效应[16]，说明NE诱导心肌原癌基因表达是通过α受体发挥作用的. 我们发现PKC的阻断剂白屈菜季氨碱和RSG可抑制NE和PMA诱导的cfos表达增强的效应，说明PKC和cfos可能是NE和PMA引起在心肌细胞肥大原因之一. 因此抑制PKC活性和cfos表达的RSG,che有抗心肌肥大的效应.

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